一種miRNA-21a抑制劑及在制備延緩心肌梗死的藥物中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,提供了一種miRNA?21a抑制劑，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明還提供了上述的miRNA?21a抑制劑在制備抑制心肌梗死早期炎癥或延緩心肌梗死早期炎癥病程發(fā)展的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的miRNA?21a在心肌梗死早期表達顯著增加，miRNA?21a抑制劑在體內(nèi)、體外應(yīng)用均能夠抑制心肌梗死及相關(guān)因素造成的炎癥增加，發(fā)揮心肌梗死早期抗炎作用。本發(fā)明可用于制備抑制心肌梗死早期炎癥以及延緩心肌梗死病程發(fā)展的藥物。
【專利說明】
-種m i RNA-21 a抑制劑及在制備延緩心肌梗死的藥物中的 用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及一種RNA小分子的抑制劑，具體來說是一種 miRNA-2 la抑制劑及在制備延緩?fù)?、肌梗死的藥物中的用途?br>【背景技術(shù)】
[0002] 屯、肌梗死等缺血性屯、臟病發(fā)病率高，致殘率和死亡率高，是危害人類健康的主要 疾病之一。據(jù)統(tǒng)計，我國每年屯、肌梗死的新發(fā)生患者達50萬，現(xiàn)患者為250萬，其中1/2已經(jīng) 喪失勞動能力【中國屯、血管病報告，陳偉偉等著，中國大百科全書出版社，2014年】。屯、肌缺 血后最有效的治療方法是盡快恢復(fù)缺血區(qū)域的血流，然而事實上缺血屯、肌恢復(fù)再灌注后損 傷反而較缺血期加重，其超微結(jié)構(gòu)、功能、代謝及電生理等方面發(fā)生進一步的損傷，稱為屯、 肌缺血再灌注損傷，是導(dǎo)致缺血性屯、臟病發(fā)作患者傷殘甚至死亡的重要因。研究表明，在急 性屯、肌梗死后的最終梗死面積中，大約50%是由缺血再灌注損傷造成的【Yellon，DM.等， Myocardial reperfusion in化；ry.N E；ngl J Med.2007.357(11): 1121-35.】。此外，屯、肌缺 血再灌注損傷還發(fā)生于屯、臟移植和冠脈搭橋術(shù)后。缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning, IPC)是目前已知的最有力的屯、肌保護干預(yù)措施，但由于其需要在屯、肌缺 血發(fā)生前實施干預(yù)，所W臨床應(yīng)用受到了極大地限制【Cokkinos ,DV .等，Myocardial protection in man from research concept to clinical practice.Heart Fail Rev. 2007.12(3-4): 345-62.】；缺血后處理（ischemia postconditioning，IPOC)解決了預(yù) 處理存在的干預(yù)時機問題，但因需要對屯、肌和冠狀動脈實施有創(chuàng)操作，適用范圍有限 【Sadat,U.等，Cardioprotection by ischemic postconditioning during surgical prodedures.E 邱 e;rt Rev Cardiovasc Ther.2008.6(7) :999-1006.】；其他外源性保護方 法，如增加屯、肌氧和能量供應(yīng)，減輕屯、臟負擔(dān)，減少能量消耗等，均有不足和副作用。因此深 入研究屯、肌梗死等缺血性屯、臟病的發(fā)病機制，探索其更有效的防治方法，仍是醫(yī)學(xué)科學(xué)研 究的重要任務(wù)。
[0003] 機體免疫系統(tǒng)對屯、血管病的發(fā)生發(fā)展起著雙刃劍的作用。一方面，免疫系統(tǒng)可通 過防御、監(jiān)視和自穩(wěn)功能保護屯、血管系統(tǒng)，抵抗疾病；另一方面，局部免疫反應(yīng)可引起屯、血 管微環(huán)境的改變，促進疾病的發(fā)生或（和）發(fā)展【〔日11196611，^.等，1^7111911〇。八63 3]1(11:110 adventitial immune response in atherosclerosis .Circ Res.2012.110(6):889- 900.】。屯、血管疾病的免疫學(xué)發(fā)病機制已引發(fā)廣大科研和臨床工作者的關(guān)注，屯、血管病免疫 學(xué)已迅速發(fā)展成為一口新興的分支學(xué)科。固有免疫應(yīng)答是屯、肌梗死等缺血性屯、臟病發(fā)生發(fā) 展的重要機制，主要表現(xiàn)為炎性細胞因子的表達顯著升高，包括腫瘤壞死因子(TNF)-a，白 細胞介素（IU-化，IL-6,化-8,干擾素（IFN)-丫和細胞粘附分子-1等運些炎性細胞因子直 接參與屯、肌梗死等缺血性屯、臟病的發(fā)生發(fā)展。屯、肌梗死后屯、肌組織缺血缺氧釋放內(nèi)源性危 險因子如DAMPS,釋放的DAMPS可W結(jié)合細胞表面相應(yīng)受體，活化下游炎癥信號通路，NF-KB 蛋白家族是一種多效性的轉(zhuǎn)錄因子，可W與多種基因啟動子部位的KB位點發(fā)生特異性的結(jié) 合從而促進其轉(zhuǎn)錄表達，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。TLRs是機體免疫系統(tǒng)識別 外界病原，激活固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵受體。TLRs信號通路的發(fā)現(xiàn)為許多相關(guān)疾病的治療提 供了新的祀點，TLRs通路的激活可W改變屯、血管局部的微環(huán)境，從而促進屯、血管疾病的發(fā) 生發(fā)展。如在屯、肌缺血再灌注損傷中，致病因子活性氧正是通過化R4信號通路激活核因子 (Nuclear factor,NF)-KB【Aderem,A.等，Toll-like receptors in the induction of the innate immune response . Nature .2000.406:782-87;Ha ,T.等，Tol1-1 ike receptors : new players in myocardial ischemia/reperfusion injury .Antioxid Redox Signal.2011.15(7):1875-93;Arslan,F.等.Bridging innate immunity and myocardial ischemia/reperfusion injury: the search for therapeutic 1:a;rgets .Qirr.Pharm.Des. 14,1205-1216(2008).】。
[0004] MiRNAs是一類由21~23個核巧酸構(gòu)成的功能性非編碼小分子，可通過結(jié)合祀基因 信使RNA來調(diào)芐基因的表達，從而發(fā)揮生物學(xué)調(diào)節(jié)功能，包括調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答、屯、血管疾 病的發(fā)生發(fā)展等。通過miRNAs調(diào)節(jié)疾病相關(guān)基因的表達，從而達到防治疾病的目的，是目前 研究工作的重點和熱點。NF-kB信號通路介導(dǎo)固有免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)設(shè)及上百個基因的 表達。運一過程必須嚴(yán)格調(diào)控，使病原體和(或)危險分子被清除，同時避免炎癥反應(yīng)過度。 越來越多的證據(jù)表明：miRNAs在調(diào)控固有免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用【Sheedy， FJ.等，Adding fuel to fire:microRNAs as a new class of mediators of inf lammation. Ann liheum Dis. 2008.67suppl :ii巧〇-ii巧5.】。最近發(fā)現(xiàn)一些miRNAs，如 miR-1，11111?-133，11111?歴-21日日，11111?-320和11111?-199日參與屯、血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程 【Belevych,AE.等，MicroRNA-land-133increase arrhythmogenesis in heart failure by dissociating phosphatase activity from RyR2complex.PLoS One.2011.6(12): e28324;Han,M.等，MicroRNAs in the cardiovascular system.Curr Opin Cardiol.2011.26(3):181-9;Bauersachs,J.等,miRNA-21aa:a central regulator of fibrosis not only in the broken heart. Cardiovase Res .2012.96(2):227-9; discussion 230-3.】。尤其是miRNA-21aa被報道可W參與屯、肌梗死后屯、肌細胞調(diào)亡、屯、肌 纖維化和屯、臟重構(gòu)等病理變化過程。但目前為止，尚未見報道m(xù)iRNA-21aa對屯、梗后早期炎 癥的調(diào)控作用。
[0005] 正是基于W上研究背景，本發(fā)明研究了 miRNA-21a抑制劑在小鼠屯、梗后早期炎癥 反應(yīng)中的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)miRNA-21a抑制劑能夠抑制屯、梗后早期的炎癥反應(yīng)，從而在屯、梗早 期發(fā)揮抗炎作用，延緩?fù)?、梗病程發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種miRNA-21a抑制劑及在制備 延緩?fù)?、肌梗死的藥物中的用途，所述的運種miRNA-21a抑制劑及在制備延緩?fù)汀⒓」Ｋ赖乃?物中的用途要解決現(xiàn)有技術(shù)中的藥物對于屯、梗后早期炎癥的治療和預(yù)防效果不佳的技術(shù) 問題。
[0007] 本發(fā)明提供了一種miRNA-21a抑制劑，其核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[000引本發(fā)明還提供了上述的一種miRNA-21a抑制劑在制備抑制屯、肌梗死早期炎癥或延 緩?fù)汀⒓」Ｋ啦〕贪l(fā)展的藥物中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，含有上述miRNA-21a抑制劑。
[0010] 進一步的，上述的藥物組合物，還含有藥學(xué)上可接受的載體或輔料。
[0011] 本發(fā)明還提供了上述的一種藥物組合物在制備抑制屯、肌梗死早期炎癥或延緩?fù)汀?肌梗死病程發(fā)展的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的miRNA-21a在屯、肌梗死早期屯、梗邊緣區(qū)屯、肌組織中表達顯著增加;此外， 本發(fā)明的miRNA-21a抑制劑能抑制屯、肌梗死早期的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎的作用。本發(fā)明 的miRNA-21a抑制劑可用于制備抑制屯、肌梗死早期炎癥W及病程發(fā)展的藥物。
【附圖說明】
[0013] 圖1:小鼠屯、肌梗死后屯、梗邊緣區(qū)屯、肌組織中miRNA-21a的表達情況(結(jié)果顯示為 平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差，n = 3;***，P<0.001)。
[0014] 圖2: miRNA-2 la抑制劑抑制屯、梗邊緣區(qū)屯、肌組織中炎性細胞因子的產(chǎn)生（結(jié)果顯 示為平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差，n = 3;*，P<0.05;**，P<0.01)。
[001引圖3:miRNA-21a的抑制物抑制小鼠細胞中DAMPS誘導(dǎo)的炎性細胞因子的產(chǎn)生。其中 圖3A為過表達miRNA-21a的抑制物抑制小鼠細胞中rmHMGBl誘導(dǎo)的炎性細胞因子的產(chǎn)生；圖 3B過表達mi RNA-21 a的抑制物抑制小鼠細胞中rmHSP60誘導(dǎo)的炎性細胞因子的產(chǎn)生(結(jié)果顯 示為平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差，n = 3;*，P<0.05;**，P<0.01)。
[0016] 實施方式
[0017] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人《分子克隆：實驗室指南》（化W York:Cold Spring化rbor LaboratoiT Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。
[0018] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述 的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0019]實施例1
[0020] miRNA-21a的序列為5 ' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3 '，而miRNA-21a抑制物設(shè)計為 單鏈RM寡核巧酸，其序列設(shè)計遵循與miRM-2 la的序列反向互補原則，即為5'- UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3 '。抑制物對照序列設(shè)計為5 ' -UUGUACUACACAAAAGUACUG-3 '，經(jīng) Blast檢索與小鼠及人的序列沒有同源或互補。miRNA-21a抑制物及對照委托廣州銳博生物 科技有限公司化學(xué)合成，并進行全鏈2'-甲氧(2'-0-Me)修飾W提高其穩(wěn)定性。
[0021] 實施例2:小鼠屯、肌梗死后屯、梗邊緣區(qū)屯、肌組織中miRNA-21a的表達上調(diào)
[0022] 小鼠（C57品系，雄性，8-10周齡，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司購買），按照 文獻報道方法建立屯、肌梗死模型【Ta;rnavski,0.等，Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies.Physiol Genomics.2004;16;349-360】， 假手術(shù)組小鼠在建立屯、肌梗死模型時只穿線不結(jié)扎前降支。分別在屯、肌梗死后3天、5天、7 天取小鼠屯、梗邊緣區(qū)屯、肌組織。
[0023] 采用實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)方法對屯、梗邊緣區(qū)屯、肌組織中miRNA-21a的表 達進行了分析。組織總RNA使用TRIZO1 (Invitrogen公司）抽提。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR試 劑盒(Takara公司）并在Li曲tCycle;r(Roche公司）實時定量PCR儀上完成。
[0024] miRNA-21a RT引物為：5'-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACT CAA CT-3'。
[0025] miRNA-21a定量PCR引物為5'-CGG CTA GCT TAT CAG ACT GA-3'（上游）和5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3'（下游）。
[00%] 內(nèi)參照U6小核RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物為5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'（即 為定量PCR的下游引物）。
[0027] U6定量PCR引物為5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'（上游）和5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'（下游）。
[002引 miRNA的相對定量使用2-AAct法計算（U6為內(nèi)參）【Livak，KJ.等，Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Δ Δ Ct method.Methods.2001；25:402-408]〇
[0029] 小鼠屯、肌梗死后屯、梗邊緣區(qū)屯、肌組織中miRNA-21a的表達情況如圖1所示。結(jié)果顯 示：小鼠屯、肌梗死后屯、梗邊緣區(qū)屯、肌組織中miRNA-21a的表達顯著升高，在屯、肌梗死后3天 到達最高值。
[0030] 該結(jié)果表明：在小鼠屯、肌梗死邊緣區(qū)屯、肌組織中miRNA-21a是屯、肌梗死后炎癥的 應(yīng)答基因。
[0031] 實施例3:miRNA-21a抑制劑抑制小鼠屯、梗邊緣區(qū)屯、肌組織中的炎性細胞因子的產(chǎn) 生
[0032] 小鼠（C57品系，雄性，8-10周齡，上海南方模式生物研究中屯、購買），如實施例1所 述制備小鼠屯、肌梗死模型，屯、梗組織局部注射攜帶miRNA-21a抑制劑的腺病毒載體和對照 抑制腺病毒載體(上海和元生物技術(shù)有限公司合成），分別在屯、肌梗死后3天、5天、7天取小 鼠屯、梗正常區(qū)屯、肌組織和屯、梗邊緣區(qū)屯、肌組織。
[0033] 采用實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)方法對屯、梗屯、肌組織中炎性細胞因子的表達 進行了分析。組織總RNA使用TRIZO1 (Invitrogen公司）抽提。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR試劑 盒(Takara公司）并在Li曲tCycle;r(Roche公司）實時定量PCR儀上完成。
[0034] 化-10定量？〔3引物為5'-66了6了6了64〔61'1'(：(^41'了464(：-3'（上游）和5'- CATGGAGAATATCACTTGTTGGTTGA-3 '（下游）。
[0035] IL-6定量PCR 引物為5 ' -TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3 '（上游）和5 ' - TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3 '（下游）。
[0036] TNF-a 定量PCR 引物為 5 ' -AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3 '（上游）和5 ' - GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3 '（下游）。
[0037] 內(nèi)參GAPDH定量PCR 引物為5 ' -AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3 '（上游）和5 ' - TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3 '（下游）。
[003引 mRNA的相對定量使用法計算（GAPDH為內(nèi)參）【Livak，KJ.等，Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Δ Δ Ct method.Methods.2001；25:402-408]〇
[0039] miRNA-21a抑制劑對小鼠屯、梗屯、肌組織中的炎性細胞因子的產(chǎn)生情況如圖2所示。 結(jié)果顯示:miRNA-21a抑制劑能抑制小鼠屯、梗邊緣區(qū)屯、肌組織中IL-lf3、IL-6、TNF-a的產(chǎn)生。
[0040] 該結(jié)果表明：miRNA-21a抑制劑可抑制小鼠屯、梗邊緣區(qū)屯、肌組織中炎性細胞因子 的產(chǎn)生。
[0041] 實施例4:miRNA-21a的抑制劑抑制巨隧細胞中DAMPS誘導(dǎo)的炎性細胞因子的產(chǎn)生
[0042] 小鼠（C57品系，雌性，4-6周齡，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司購買)腹腔注 射肉湯(購自Sigma公司）2ml/只，兩天后W無血清RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗腹腔，按照文獻報 道方法獲得原代腹腔巨隧細胞【Hou，J.等，MicroRNA-146a feedback inhibits RIG-I- dependent Type I IFN production in macrophages by targeting TRAF6, IRAKI,and IRAK2.J Immunol.2009;183:2150-2158】。巨隧細胞（5X10日個細胞/1ml RPMI 1640培養(yǎng) 基)使用INTERF邸in轉(zhuǎn)染試劑(Polyplus公司）轉(zhuǎn)染miRNA-21a的抑制物及小RNA對照（終濃 度為lOOnM)至巨隧細胞中。轉(zhuǎn)染后48小時，細胞用O.lmg/ml rmHMGBl或者rmHSP60(購自 CUSABI0公司），刺激0、4、8小時后，收集細胞培養(yǎng)上清利用化ISA(所用試劑盒購自R&D公司） 檢測炎性細胞因子蛋白水平。
[0043] ELISA分析的結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示:過表達miRNA-21a的抑制物可減少小鼠巨 隧細胞中rmHMGB 1和rmHSP60誘導(dǎo)的IL-1 β、IL-6、TNF-a的產(chǎn)生。
[0044] 該結(jié)果表明:miRNA-21a抑制劑可抑制巨隧細胞中DAMPS誘導(dǎo)的炎性細胞因子的產(chǎn) 生。
[0045] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 W對本發(fā)明作各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種miRNA-21a抑制劑，其核苷酸序列如SEQIDN0:l所示。2. 權(quán)利要求1所述的一種miRNA-21a抑制劑在制備抑制心肌梗死早期炎癥或延緩心肌 梗死病程發(fā)展的藥物中的應(yīng)用。3. -種藥物組合物，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述miRNA-21a抑制劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于：還含有藥學(xué)上可接受的載體或輔 料。5. 權(quán)利要求3所述的一種藥物組合物在制備抑制心肌梗死早期炎癥或延緩心肌梗死病 程發(fā)展的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K48/00GK105999302SQ201610420350
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】占貞貞, 楊琳珊, 劉中民
【申請人】上海市東方醫(yī)院