專利名稱：：由印尼莪術(shù)分離的免疫增強用多糖類及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及由印尼莪術(shù)(O^cwwaxawAo/r/^a)分離的有效的多糖類、及其制造方法、以及被分離的多糖類的用途。
背景技術(shù)：
：當(dāng)生物體受細菌、真菌及病毒的感染時，具有巨噬細胞活化功能的多糖類，擁有使在被誘發(fā)的生物體的防御機制中起重要作用的巨噬細胞活化的功能。此時，上述巨噬細胞被分類為免疫細胞(cellularimmunity)，通過巨噬細胞活化與補體、天然殺傷細胞(NKcdl)等的免疫細胞進行反應(yīng)，成為免疫系統(tǒng)的中樞(Plafair,J,H，L:ImmunologyataGlance5thed.BlackwellScientificPublications.London,1992)。巨噬細胞在暴露于細菌或外部的剌激性物質(zhì)中時被活化，成為被活化的巨噬細胞。被活化的巨噬細胞顯示出吞噬細胞作用、前列腺素(prostaglandin)分泌增加等的多種酶的蛋白質(zhì)合成機能增加的功能性變化，其細胞的大小和細胞分泌物會增加。特別是，在對癌細胞的細胞毒性作用機理中，己知，通過被活化的巨噬細胞分泌的細胞因子(IL-lp,IL-6,TNF-oO、過氧化氫(H202)、亞硝酸(NO)、細胞毒性蛋白分解酶(cytolyticprotease)等對癌細胞顯示出細胞毒性(HibbsJ.B.etal.,祝oc/ze肌所o;/z".Cbwmw""157:87-94，1998)。雖然被活化的巨噬細胞具有抗微生物作用、抗癌作用，但實際上在癌患者的生物體內(nèi)的抗癌作用不會單獨有效，且通過以往的化學(xué)療法、放射線療法進行的抗癌療法會誘發(fā)非常嚴重的高熱、發(fā)汗、頭痛以及嘔吐等的全身副作用，因而，可以說通過免疫增強活性的抗癌治療的開發(fā)具有極其重要的意義。已知有多種生物化學(xué)現(xiàn)象參與到免疫調(diào)節(jié)中，特別是，與作為產(chǎn)生氧化氮(nitricoxide:NO)的酶的一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase:NOS)禾口前列腺素的生物合成相關(guān)的酶等起到重要的作用。因此，作為由L-精氨酸(L-arginine)生成NO的酶的NOS或者作為有關(guān)由花生四烯酸(ArachidonicAcid)合成前列腺素類的環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)被視為免疫調(diào)節(jié)的重要的指標(biāo)(ChiharaG.etal.，Immunology,34:695-711,1978)。NOS以及COX—2的表達是通過復(fù)雜的細胞傳達過程而實現(xiàn)，有將外部信號傳達至細胞內(nèi)的多種激酶(kinase)等的參與，但在其中，主要是對細胞核因子-kb(nuclearfactorkappaB，NF-kB)、iNOS以及COX—2的表達產(chǎn)生影響。酪氨酸(tyrosine)或絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threoninekinases)通過LPS或TNF—a等的剌激被磷酸化及活化，而存在于細胞質(zhì)的作為NF—kB復(fù)合體的抑制結(jié)構(gòu)要素的抑制性蛋白(inhibitorkappaB,IkB)則通過I—kB激酶被磷酸化以及活化，并被蛋白分解，由此NF—kB被活化(D'AcquistoF.etal.，Mo/.Interv.2:22-35,2002)。轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor)NF—kB作為序列特異的DNA結(jié)合蛋白，是誘發(fā)參與到細胞生長、分化以及免疫反應(yīng)中的多種基因轉(zhuǎn)錄的重要因子。因此，對在不顯示副作用的同時能夠活化巨噬細胞的天然物質(zhì)的研究進行得非?；钴S，并主要作為以高分子級分而非低分子級分而顯示出其活性的物質(zhì)而公知。來自天然物質(zhì)的免疫增強劑，通過強化免疫反應(yīng)或者恢復(fù)已降低的免疫功能，應(yīng)用于癌癥治療、免疫缺乏癥治療、慢性感染等的治療中。以往，為了從天然物質(zhì)得到免疫活性調(diào)節(jié)物質(zhì)，對擔(dān)子菌類、真菌類以及藥用植物類進行了研究，特別是，對作為這些物質(zhì)的高分子級分成分的多糖類等已有了很多報告，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了抗癌活性、抗補體活性以及淋巴細胞分裂誘導(dǎo)等的免疫調(diào)節(jié)活性。至今為止，主要是來自于蘑菇類的香菇多糖(Lentinan)、裂裥菌多糖(Schzophyllan)、百士欣(Bestatin)、云芝多糖k(krestin)以及肽PSK(peptidePSK)等葡聚糖(glucan)類多糖被應(yīng)用于抗癌治療中。另一方面，印尼莪術(shù)屬于姜科植物，通常是作為大姜黃(temulawak)或者爪哇姜黃(Javaneseturmeric)而廣為人知的印尼的傳統(tǒng)藥用植物，其主要成分含有芳香-姜黃酮(artumenone)、a-姜黃烯、卩-姜黃烯、莪術(shù)呋喃酮、吉馬酮、P-倍半水芹烯、a-姜黃酮、卩-姜黃酮、黃根醇等的類萜系列化合物和7_30%的精油、30—40%的碳水化合物、以及0.02—2.0%的作為芳香性色素的類姜黃色素等(LinS.C.etal.，Am.J.Chin.Med"23:243-254,1995)。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供一種由天然物質(zhì)分離出的具有安全性的同時免疫增強效果及/或抗癌效果優(yōu)異的物質(zhì)、其制造方法、以及該物質(zhì)的用途b為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種由印尼莪術(shù)分離的多糖類的制造方法，其特征在于，包括(51)準備印尼莪術(shù)根(CurcumaxanthorrhizaRoxb.)的粉末的工序；(52)用有機溶劑提取上述粉末后，進行過濾或離心分離而得到濾渣的工序；(53)提取上述濾渣，從而配制含有多糖類的溶液的工序；(54)往上述含有多糖類的溶液中添加淀粉水解酶，從而去除淀粉的工序；(55)在上述(S4)工序后對多糖類進行沉淀的工序；及(56)在上述(S5)工序后對多糖類進行精制的工序。本發(fā)明還提供一種由印尼莪術(shù)分離的多糖類以及免疫增強劑組合物，其特征在于，所述由印尼莪術(shù)分離的多糖類是通過上述制造方法而得到，所述免疫增強劑組合物含有該多糖類。本發(fā)明人等以多種天然物質(zhì)為對象進行了尋求免疫增強活性劑的研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)從印尼莪術(shù)的根分離出的多糖類顯示免疫增強活性，從而完成了本發(fā)明。下面，對本發(fā)明的由印尼莪術(shù)分離出的免疫增強多糖類、其制造方法、及含有該多糖類的免疫增強組合物或者抗癌輔助劑組合物進行更加詳細的說明。本發(fā)明提供一種由印尼莪術(shù)分離的多糖類的制造方法，其特征在于，包括(51)準備印尼莪術(shù)根的粉末的工序；(52)用有機溶劑提取上述粉末后，進行過濾或離心分離而得到濾渣的工序；(53)提取上述濾渣，從而配制含有多糖類的溶液的工序；(54)往上述含有多糖類的溶液中添加淀粉水解酶，從而去除淀粉的工序；(55)在上述(S4)工序后對多糖類進行沉淀的工序；及(56)在上述(S5)工序后對多糖類進行精制的工序。本發(fā)明的制造方法包括(Sl)準備印尼莪術(shù)根的粉末的工序。印尼莪術(shù)根的粉末可通過本
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中通常使用的粉末化方法來進行準備。本發(fā)明的制造方法包括(S2)用有機溶劑提取上述粉末后，進行過濾或離心分離而得到濾渣的工序。作為有機溶劑，可以單獨或混合使用甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、丙酮、乙醚，苯、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷，己烷、環(huán)己烷、石油醚等，但并不限于此。其中，可優(yōu)選使用乙醇、甲醇，己烷或者它們的混合物。本發(fā)明的制造方法包括(S3)提取上述濾渣，從而配制含有多糖類的溶液的工序。其中，優(yōu)選用熱水、酸溶液或者堿溶液對濾渣進行提取而得到包含在上述濾渣中的多糖類成分。熱水可以使用具有能夠溶解多糖類程度的溫度的純水，優(yōu)選可使用約70100。C的純水。作為酸溶液，只要是本領(lǐng)域中公知的具有能夠溶解多糖類程度的酸性的溶液，都可以使用，例如可以舉出檸檬酸、富馬酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、蘋果酸、草酸、天冬氨酸、谷氨酸、棕櫚酸、丙酸、抗壞血酸、殼聚糖(Chitosan)、馬尿酸、藻酸、膽堿酸(cholineacid)、丁酸、安息香酸、甲磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、水楊酸、葡萄糖酸、乙醇酸、扁桃酸、肉桂酸等有機酸溶液；以及鹽酸、磷酸、醋酸、三氟醋酸、氫溴酸、硫酸等的無機酸溶液，但并不限于此，這些可以使用一種以上。但是，從制造成本等的多種角度考慮時，優(yōu)選0.00510N的HC1溶液，更優(yōu)選0.15N的HC1溶液。作為堿溶液，只要是本領(lǐng)域中公知的具有能夠溶解多糖類程度的堿性的溶液，都可以使用，例如可以使用氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、吡啶、三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺等，這些可以使用一種以上，但并不限于此。只是從制造成本等的多種角度考慮時，優(yōu)選0.00510N的NaOH溶液，更優(yōu)選0.15N的NaOH溶液。本發(fā)明的制造方法包括(S4)往上述含有多糖類的溶液中添加淀粉水解酶，從而去除淀粉的工序。淀粉水解酶優(yōu)選使用a-淀粉酶(tx-amylase)、葡糖淀粉酶(Glucoamylase)等。本發(fā)明的制造方法包括(S5)在上述(S4)工序后對多糖類進行沉淀的工序。優(yōu)選通過往去除了淀粉的含有多糖類的溶液中添加甲醇、乙醇、異丙醇、丙醇，正丁醇、異丁醇、叔丁醇，乙二醇、丙撐二醇、丙三醇、三甲撐二醇等的低級醇，對溶液中含有的多糖類進行沉淀。本發(fā)明的制造方法包括(S6)在上述(S5)工序后對多糖類進行精制的工序。通過使用透析、超濾(ultrafiltration)等的分子量分級系統(tǒng)，去除被沉淀的多糖類級分中的低分子量成分，由此能夠?qū)Χ嗵穷愡M行精制。透析、超濾等中，優(yōu)選使用分子量分離點標(biāo)準為50010000，優(yōu)選為5005000，更優(yōu)選為10005000的膜。本發(fā)明還提供通過上述制造方法得到的由印尼莪術(shù)分離的多糖類，進一步，還提供作為有效成分含有該多糖類的藥物組合物。對通過上述工序由印尼莪術(shù)分離精制而得到的多糖類實施了免疫增強活性試驗，其結(jié)果是能夠使作為免疫增強指標(biāo)的NO、11202及PGE2的生成量、吞噬能力、iNOS、TNF-a、COX-2mRNA以及蛋白質(zhì)表達增加。而且，還顯示出癌細胞殺傷功能和抗癌效果。如此的活性意味著由印尼莪術(shù)分離精制的多糖類可有效地用作免疫增強劑組合物以及抗癌輔助劑組合物。即，本發(fā)明的多糖類能夠活化巨噬細胞，可極其有效地用于包括癌癥的有關(guān)免疫類疾病的預(yù)防、治療以及治療后的免疫增強用藥品和功能性食品。進一步，本發(fā)明的免疫增強劑組合物在因免疫降低引起的疾病的治療中，g卩，在臨床免疫學(xué)上的疑難病癥、慢性疾病、糖尿病、癌癥、男性不孕癥、后天免疫缺乏癥(AIDS)、病理學(xué)上的病毒癥、機會感染以及因放射線照射引起的疾病治療中，可作為有效成分使用。含有用本發(fā)明的制造方法得到的多糖類的組合物，可通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
中公知的方法制造成醫(yī)藥品以及功能性食品的形式。該醫(yī)藥品以及功能性食品可含有藥學(xué)上允許的賦形劑或添加劑。本發(fā)明的含多糖類的組合物可以單獨或者與適當(dāng)?shù)倪\送體、賦形劑等加以混合的劑型給藥，如此的給藥劑型還可以是單次給藥劑型或重復(fù)給藥劑型。含有本發(fā)明的組合物的醫(yī)藥品或功能性食品，可以是固體制劑或液體制劑。固體制劑有散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、栓劑等，但并不限于此。固體制劑可含有賦形劑、香味劑、結(jié)合劑、防腐劑、崩解劑、潤滑劑、填充劑等，但并不限于此。液體制劑有如水、丙二醇的溶液制劑、懸浮劑、乳劑等，但并不限于此，還可以添加適當(dāng)?shù)闹珓?、香味劑、穩(wěn)定劑、粘合劑等而制成。例如，散劑可通過將本發(fā)明的多糖類與乳糖、淀粉、微結(jié)晶纖維等的藥學(xué)上允許的適當(dāng)?shù)馁x形劑進行簡單混合而制成。顆粒劑可通過將本發(fā)明的多糖類與藥學(xué)上允許的適當(dāng)?shù)馁x形劑以及藥學(xué)上允許的如聚乙烯吡咯垸酮、羥丙基纖維素等的適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合劑加以混合后，通過使用了水、乙醇、異丙醇等溶劑的濕式顆粒法或者通過利用了壓縮力的干式顆粒法而制成。進一步，片劑可通過將上述顆粒劑與硬脂酸鎂等藥學(xué)上允許的適當(dāng)?shù)臐櫥瑒┘右曰旌虾螅脡浩瑱C進行壓片而制成。本發(fā)明的組合物根據(jù)需要治療的疾病以及患者個體的狀態(tài)，能夠以口服給藥、注射給藥、吸入給藥、鼻腔給藥、腔給藥、直腸給藥、舌下給藥等方式給藥，但并不限于此。根據(jù)給藥途徑，可制成本領(lǐng)域中通常使用的含有非毒性的且藥學(xué)上允許的輸送體、添加劑、傳播媒介的適當(dāng)?shù)慕o藥劑型單元。本發(fā)明的多糖類的每天給藥量可約為0.2200mg/kg，優(yōu)選為約250mg/kg，更優(yōu)選為530mg/kg。但是，該投藥量可根據(jù)患者的狀況(年齡、性別、體重等)、病癥的嚴重性、所使用的有效成分、飲食等多樣化?？筛鶕?jù)需要，也為了圖方便，將一天的總給藥量分成在一天內(nèi)數(shù)次給藥。本發(fā)明還提供抗癌補助方法以及免疫增強方法，其特征在于，將本發(fā)明的多糖類作為有效成分而給藥。將本發(fā)明的多糖類向大鼠口服給藥而進行毒性試驗，其結(jié)果是口服毒性試驗的50%致死量(LD5。)顯示為2000mg/kg以上，由此能夠確認本發(fā)明的多糖類非常安全。圖1為從印尼莪術(shù)分離免疫增強多糖類的工序圖。圖2為用凝膠滲透色譜法測定從印尼莪術(shù)分離的多糖類的分子量的結(jié)果。A:作為標(biāo)準物使用的普魯蘭多糖的凝膠滲透色譜圖(分子量=788000,112000,22800,5900,360)。B:從印尼莪術(shù)分離的多糖類的凝膠滲透色譜圖。圖3表示用Bio-LC測定本發(fā)明的從印尼莪術(shù)分離的多糖類的糖含量的結(jié)果。A:作為標(biāo)準物使用的葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖的色譜圖。B:從印尼莪術(shù)分離的多糖類的糖含量色譜圖。圖4為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在NO生成的增加上的效果的圖。圖5為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在H202生成的增加上的效果的圖。圖6為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在吞噬能力的增加上的效果的圖。A:無試樣處理組B:用30ug/ml濃度試樣處理的組圖7為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在TNF-a蛋白質(zhì)表達增加上的效果的圖。圖8為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在TNF-amRNA表達增加上的效果的圖。圖9為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在iNOS蛋白質(zhì)表達增加上的效果的圖。圖10為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在iNOSmRNA表達增加上的效果的圖。圖11為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在COX-2蛋白質(zhì)表達增加上的效果的圖。圖12為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在COX-2mRNA蛋白質(zhì)表達增加上的效果的圖。圖13為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類的lKBa磷酸化的圖。圖14為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在生物體內(nèi)的NO生成增加上的效果的圖。圖15為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在生物體內(nèi)的吞噬作用增加上的效果的圖。圖16為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在生物體內(nèi)的癌細胞殺傷功能增加上的效果的圖。圖17為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在生物體內(nèi)的iNOSmRNA表達增加上的效果的圖。圖18為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在生物體內(nèi)的TNF-amRNA表達增加上的效果的圖。圖19為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在生物體內(nèi)的IL-lJ3mRNA表達增加上的效果的圖。圖20為表示從印尼莪術(shù)分離的多糖類在生物體內(nèi)的IL-6mRNA表達增加上的效果的圖。具體實施方式下面，通過舉出下述實施例等，對本發(fā)明進行更加詳細的說明。但是，本發(fā)明的實施例可變更為多種方式，不能解釋為下面詳細記載的實施例等限定了本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的實施例等只是為了更加具體地理解本發(fā)明而例示的。在下面的全部試驗結(jié)果中，活性分析重復(fù)進行3次以上，并將其結(jié)果用平均士標(biāo)準偏差來表示。統(tǒng)計分析則用鄧肯檢驗(Duncantest)(SPSS12.0)來進行，并認為>值在0.05以下、》值在0.01以下的情況下為統(tǒng)計學(xué)上有效。實施例l:從印尼莪術(shù)分離多糖類在15g印尼莪術(shù)根的粉末中添加750ml的100X乙醇，在78。C、2小時的條件下提取兩次。將所得到的提取物用沃特曼(Whatman)濾紙(No.2)分離為上清液和濾渣。作為提取溶劑在濾渣中添加750ml、O，IN的NaOH后，在97。C下、2小時內(nèi)提取兩次。為了對上述所得到的0.1N的NaOH提取物中含有的淀粉進行水解，在酶的最適宜條件下，用a-淀粉酶(Termamyl120L，NOVONordiskA/S，Denmark)和葡糖淀粉酶(AMG300L,NOVONordiskA/S，Denmark)進行處理后加以中和。在上述濾液中添加其4倍體積的異丙醇，在4"C下放置24小時而沉淀多糖類后，以6500rpm迸行15分鐘的離心分離而分離上清液。將分離得到的沉淀物溶解在蒸餾水而制備1%溶液，并用分子量分離點為1000的膜進行超濾(細通道超濾(thinchannelultrafiltrationsystem),AmiconTCF-10;AmiconCo.,U.S.A.)。超濾后，收集分子量為1000以上的溶液，對其進行冷凍干燥，由此得到多糖類，收率為6%。將如此得到的多糖類命名為"姜黃素一X(Curcuman-X)"。將本發(fā)明的實施例1中的整個的提取及分離工序示于圖1中。實驗例l:分子量測定通過凝膠滲透色譜法測定上述實施例1中由印尼莪術(shù)分離的多糖類姜黃素—X的分子量。色譜柱使用色譜柱(型號Ultmhydrogd線性色譜柱)和色譜柱(型號Ultmhydrogd500色譜柱)，流動相使用0.1N的NaN02。在分析時，流動相的速度為lml/min，作為標(biāo)準物質(zhì)使用普魯蘭多糖。將實驗結(jié)果示于圖2中。如圖2所示，確認姜黃素一X的數(shù)均分子量為33000Da。實驗例2:糖成分的測定用生物液相色譜儀(Bio-LC)(DionexDX-500，USA)，對上述實施例1中由印尼莪術(shù)分離的多糖類姜黃素一X的糖成分的含量進行測定。在10mg多糖類中添加lOOpl、24N的硫酸反應(yīng)一小時后，進行氮氣填充，并在IOO。C下進行三小時的水解。冷卻至室溫后，將冷卻后的反應(yīng)物與12N的氫氧化銨反應(yīng)而進行中和，用蒸餾水加以稀釋。用濾紙過濾稀釋液，通過Bio-LC測定糖含量。作為Bio-LC的分析條件，色譜柱使用CarboPacTMPA1，溶出液(isocraticeluent)使用22.6mM的NaOH，緩沖溶液使用200mM的NaOH。溶出液的流速為0.3ml/min，試樣注入量為50^1，并在氮氣條件下進行。作為糖標(biāo)準物，使用葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖，通過保留時間(retentiontime)來確認各糖。將多糖類的糖含量測定結(jié)果示于圖3中，將糖成分的含量示于下述的表1中。如表1所示，從印尼莪術(shù)分離的多糖類的主要構(gòu)成成分為葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、以及甘露糖。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實驗例3:NO生成的測定為了探明上述實施例1中分離的多糖類的免疫調(diào)節(jié)效果和NO分泌之間的相關(guān)關(guān)系，用RAW264.7巨噬細胞觀察NO生成功能力。使用含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100ng/ml鏈霉素的達氏修正依氏培養(yǎng)基(Dulbecco'smodifiedeaglesmedium)(Gibco,USA)的完全培養(yǎng)基，在37。C的C02培養(yǎng)器中培養(yǎng)鼠的巨噬細胞株RAW264.7細胞。以2xl()S細胞/ml濃度分別取各RAW264.7巨噬細胞，在37。C的002培養(yǎng)器中培養(yǎng)4小時后，用姜黃素一X以(5，10,30,50^ig/ml)的濃度分別進行處理，作為對照組則用1(Vg/ml的脂多糖(lipopolysaccharide)進行處理后培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，用格式檢驗法(Griessassay)(Griess.P.，Chem.Ber.12:426-428,1897)，測定培養(yǎng)上清液中的亞硝酸鹽(NO的穩(wěn)定的水合物)的濃度。即，將NaN02作為標(biāo)準物質(zhì)，使用格里斯試劑(0.5%磺胺(sulfanilyamide)，0.05。/。N-(l-萘基)乙二胺二鹽酸鹽/2.5。/。H3PC)4)，在540nm下測定試樣的吸光度。實驗結(jié)果為如圖4所示，相比于未用試樣處理的組，在進行姜黃素一X處理的組中，顯示出非常高的NO生成量，并確認了該數(shù)值依賴于濃度的增加而增加。這意味著從印尼莪術(shù)分離的多糖類能夠大幅增加巨噬細胞的NO生成功能。實驗例4:&02生成的測定為了探明上述實施例1中分離的多糖類的免疫調(diào)節(jié)效果和11202分泌之間的相關(guān)關(guān)系，用RAW264.7巨噬細胞觀察H202的生成功能。使用含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100pg/ml鏈霉素的達氏修正依氏培養(yǎng)基(Gibco，USA)的完全培養(yǎng)基，在37。C的C02培養(yǎng)器中培養(yǎng)大鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞。通過用安普萊克司紅色試劑(AmplexRedreagent)(10-乙酰基-3,7-二羥基吩嗪)測定酚紅的依賴于辣根過氧化物酶(horseradishperoxcidase、HRP)的氧化過程的顯色反應(yīng)，由此測定過氧化氫的生成。以2xl(^細胞/ml濃度下分別取各RAW264.7巨噬細胞，用50mM的安普萊克司紅色試劑和0.1U/mlHRP的葡萄糖磷酸緩沖液(Krebs-Ringerphosphate)(145mM的NaCl，5.7mM的磷酸鈉，4.86mM的KC1,0.54mM的CaCl，1.22mM的MgS04，5.5mM的葡萄糖,pH值為7.35)進行處理后，用濃度為(5，10,30,50^g/ml)的姜黃素一X分別進行處理，作為對照組則用lOpg/ml的脂多糖(lipopolysaccharide)進行處理后培養(yǎng)20小時。培養(yǎng)結(jié)束后，通過在5卯nm下測定吸光度來測定上清液中的11202濃度。實驗結(jié)果為如圖5所示，相比于未用試樣處理的組，在進行姜黃素一X處理的組中，顯示出非常高的H202生成量，并確認了該數(shù)值的增加依賴于濃度的增加而增加。當(dāng)用50嗎/ml的多糖類處理的情況下，相比于未用試樣處理的組顯示出12倍以上的H202生成量，該結(jié)果表明，多糖類相比于對照組使用的LPS更加優(yōu)異。這確認了由印尼莪術(shù)分離的多糖類具有能夠大幅增加巨噬細胞的11202生成量的作為有絲分裂原(mitogen)的活性，意味著因多糖類引起的巨噬細胞的H202增加效果，除了對從外部入侵的細菌具有破壞作用以外，對相鄰的細胞也具有極其重要的作用。實驗例5:巨噬細胞的吞噬功能測定通過RAW264.7巨噬細胞觀察在上述實施例1中分離的多糖類的吞噬功能作用，并用熱滅活的異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate、FITC)標(biāo)記的大腸桿菌生物粒子(E化/^n'c/n'aco//)(K-12株，MolecularProbes,Eugene,OR,US)測定其吞噬功能。使用含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100嗎/ml鏈霉素的達氏修正依氏培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基，在37'C的C02培養(yǎng)器中培養(yǎng)大鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞。以2xl()S細胞/ml的濃度分別取各RAW264.7巨噬細胞至96-孔板中，用濃度為(5，10,30，50i!g/ml)的姜黃素一X分別進行處理，并在37'C的C02培養(yǎng)器中進行培養(yǎng)。4小時后，分別取lO(Hil的熱滅活的異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate、FITC)標(biāo)記的大腸桿菌生物粒子(Esc/zen'c/zz'aco/f)后，培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌巨噬細胞和細菌，然后，分別取出到100ul的臺盼蘭(TiypanBlue)中在常溫下放置一分鐘后加以去除，通過熒光發(fā)光器測定吞噬功能。進一步，通過共聚焦顯微鏡(xl890)觀察姜黃素—X對被活化的巨噬細胞的巨噬活性的影響的效果。實驗結(jié)果為如圖6所示，相比于未用試樣處理的組，在用姜黃素一X處理的組中顯示出非常高的吞噬功能，且能夠確認該數(shù)值依賴于濃度的增加而增加。在圖6中，A表示未用試樣處理的組，B表示濃度為30嗎/ml的姜黃素一X處理的組。由于巨噬細胞具有能夠辨認異物質(zhì)的不同的受體(receptor)等，因此，食品或天然物質(zhì)能夠直接參與到巨噬細胞的活化，但是，也有時是依賴于通過補體或其他淋巴細胞的活性而進行的二次作用。因此，不能把握由印尼莪術(shù)分離的多糖類活化巨噬細胞的準確的機理，但是，可通過被活化的巨噬細胞大幅增加吞噬功能，能夠強化包括先天性免疫、后天性免疫的整個免疫系統(tǒng)。實驗例6:PGE2生成的測定通過RAW264.7巨噬細胞觀察上述實施例1中分離的多糖類姜黃素一X對PGE2生成的影響，并用R&D試劑盒(R&Dsystems,USA)來定量PGE2的生成。使用含有10%的胎牛血清、100imits/ml的青霉素、100嗎/ml鏈霉素的達氏修正依氏培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基，在37'C的C02培養(yǎng)器中培養(yǎng)大鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞。以2xl()S細胞/ml的濃度分別取各RAW264.7巨噬細胞至96-孔板中，使其在37'C的C02培養(yǎng)器中放置4小時穩(wěn)定，用濃度為(5，10，30，50ng/ml)的姜黃素一X分別進行處理，作為對照組則用10ug/ml的脂多糖進行處理，并培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，將上清液移至新的孔板中，并向各孔板添加lOOul的分析緩沖液(assaybuffer)、50P1的PGE2結(jié)合緩沖液(conjugatebuffe)以及PGE2抗體溶液(antibodysolution)。將如此處理過的孔板在常溫下反應(yīng)2小時。將孔板中的反應(yīng)試劑全部去除，用洗滌液洗滌各孔板后，添加50"1的PGE2結(jié)合緩沖液和200y1的pNPP基質(zhì)，使其在常溫下反應(yīng)1小時。將50u1反應(yīng)終止液添加至各孔板而終止反應(yīng)，并在405nm下測定吸光度。PGE2生成量測定結(jié)果如表2所示，相比于未用試樣處理的組，用姜黃素一X處理時顯示出非常高的PGE2生成量，且該數(shù)值依賴于濃度的增加而增加。當(dāng)用50嗎/ml的多糖類處理時，相對于未用試樣處理的組顯示出300%以上的PGE2生成量，其效果比作為對照組而使用的LPS優(yōu)異。這意味著由印尼莪術(shù)分離的多糖類姜黃素一X能夠大幅增加巨噬細胞的PGE2生成功能。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實驗例7:對iNOS、TNF-a以及COX-2分泌的影響為了探明上述實施例1中分離的姜黃素一X對iNOS、TNF-a以及COX-2蛋白質(zhì)和mRNA表達的影響，實施了免疫印跡(WestemBlot)及RT-PCR。使用含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100pg/ml鏈霉素的達氏修正依氏培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基，在37。C的C02培養(yǎng)器中培養(yǎng)大鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞(韓國細胞株銀行)。將RAW264.7細胞數(shù)調(diào)整為2xl(^細胞/ml并移至60mm培養(yǎng)器中，培養(yǎng)6小時，由此準備用以免疫印跡的細胞。將該培養(yǎng)細胞用溶解在杜氏磷酸緩沖液DPBS(Dulbecco'sPhosphateBufferedSaline)中的濃度為(5,10,30,5(^g/ml)的姜黃素一X分別進行處理，作為對照組則用10pg/ml的脂多糖進行處理。對各試樣處理24小時后，去掉培養(yǎng)器的培養(yǎng)基，用DPBS溶液洗滌兩次后，添加lml的DPBS，集中細胞等進行離心分離(1500rpm,3分鐘)，從而回收細胞。為了得到回收細胞的蛋白質(zhì)，投入100ul的緩沖溶液(裂解緩沖液，200mM的tris,150mM的NaCl，lmM的EDTA，lmM的EGTA,1°/。的triton,lmM的PMSF，蛋白酶抑制劑混合物)而破壞細胞，由此回收蛋白質(zhì)。被回收的蛋白質(zhì)通過考馬斯亮藍染色法(BradfordAssay)來定量，此時，作為標(biāo)準物使用牛血清蛋白(bovineserumalbumin)。使提取的蛋白質(zhì)在10%的SDS-聚丙烯基酰胺凝膠中進行電泳，用硝酸纖維素細胞膜(nitmcellulosemembrane)轉(zhuǎn)移凝膠的蛋白質(zhì)。為了防止膜被其他未知的蛋白質(zhì)污染，用5%脫脂奶粉(5%skimmilk)在常溫下遮擋一小時，將iNOS、TNF-a和COX-2的一次抗體用封閉緩沖液(Blockingbuffer)稀釋至1:1000的比例，使其在常溫下反應(yīng)2小時。一次抗體反應(yīng)后，用TBST(Tris-bufferSalineTween20)每10分鐘進行3次一邊搖晃一邊洗滌。將用以辨認iNOS、TNF-a和COX-2的一次抗體的二次抗體用5%脫脂萘奶粉稀釋至1:2000的比例，使其在常溫下反應(yīng)一小時，并與一次抗體的情況相同地用TBST(Tris-bufferSalineTween20)每10分鐘進行3次一邊搖晃一邊洗滌，并通過化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescence)進行顯影<>用于RT-PCR的RAW264.7細胞在60mm細胞培養(yǎng)皿中分株為2xl(^細胞/ml，并使其穩(wěn)定一晚。用試樣處理該細胞后，收集細胞用PBS洗滌，添加lml的三唑(Invitrogen,USA)并在室溫下加以攪拌。投入200iU的氯仿再次進行攪拌，并以12000rpm、4。C的條件進行15分鐘的離心分離，在其上清液中加異丙醇后，再次進行離心分離，從而得到RNA顆粒。通過MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)將在此得到的RNA制作成cDNA。向其中添加iNOS(正義5'隱CAACCAGTATTATGGCTCCT-3'，反義5'-GTGACAGCCCGGTCTTTCCA-3')，TNF畫a(正義5-CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3，反義5-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3)，COX畫2(正義5'-CCGTGGTAATGTATGAGCA，反義5'-CTCGCTTCTGATATGTCTT-3')及(3-肌動蛋白(卩-actin)(正義5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC畫3',反義5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3')的引物，并通過Taq聚合酶(taqpolymerase)對各基因進行增幅。此時，基因增幅是以在95匸下30秒、55"C下1分鐘、72'C下1分鐘為一循環(huán)，共重復(fù)循環(huán)30次后，最后在72"C下反應(yīng)5分鐘而進行。將所得到的RNA用1%瓊酯糖凝膠實施電泳，用UV檢測器進行確認。實驗結(jié)果為如圖7、9、11所示，通過姜黃素一X能夠確保iNOS、TNF-a和COX-2蛋白質(zhì)的明顯地增加，進一步，在圖8、10、12中還可以確認mRNA以與蛋白質(zhì)類似的傾向在增加。該結(jié)果意味著上述實施例中記載的NO及PGE2的增加起因于姜黃素一X對mRNA及蛋白質(zhì)表達的調(diào)節(jié)。實驗例8在測定lKBa的磷酸化為了探明上述實施例1中分離的姜黃素一X對lKBa的磷酸化的影響，實施了免疫印跡(Westernblot)。使用含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、10(Hig/ml鏈霉素的達氏修正依氏培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基，在37"C的C02培養(yǎng)器中培養(yǎng)作為大鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞(韓國細胞株銀行)。將RAW264.7細胞數(shù)調(diào)整為2xl()S細胞/ml并移至60mm培養(yǎng)器中培養(yǎng)6小時而準備用于免疫印跡的細胞。將該培養(yǎng)細胞用溶解在杜氏磷酸緩沖液DPBS中的濃度為(5,10，30，50pg/ml)的姜黃素一X分別進行處理，作為對照組則用10pg/ml的脂多糖進行處理。對各試樣處理24小時后，去掉培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基，用DPBS溶液洗滌2次后，投入lml的DPBS,收集細胞等進行離心分離(1500rpm,3分鐘)而回收細胞。為了得到回收細胞的蛋白質(zhì)，投入100ul的緩沖溶液(裂解緩沖液，200mM的tris,150mM的NaCl,lmM的EDTA，lmM的EGTA，1%的triton，lmM的PMSF，蛋白酶抑制劑混合物)而破壞細胞，由此回收蛋白質(zhì)。被回收的蛋白質(zhì)通過考馬斯亮藍染色法(BradfordAssay)來定量，此時，作為標(biāo)準物使用牛血清蛋白(bovineserumalbumin)。使提取的蛋白質(zhì)在10%的SDS-聚丙烯基酰胺凝膠中進行電泳，用硝酸纖維素細胞膜(nitrocellulosemembrane)轉(zhuǎn)移凝膠的蛋白質(zhì)。為了防止膜被其他未知的蛋白質(zhì)污染，用5%脫脂奶粉(5%skimmilk)在常溫下遮擋一小時，將pMBa的一次抗體用封閉緩沖液(Blockingbuffer)稀釋至1:1000的比例，使其在常溫下反應(yīng)2小時。一次抗體反應(yīng)后，用TBST(Tris-bufferSalineTween20)每10分鐘進行3次一邊搖晃一邊洗滌。將用以辨認一次抗體的二次抗體用5%脫脂奶粉稀釋至1:2000的比例，使其在常溫下反應(yīng)一小時，并與一次抗體的情況相同地用TBST(Tris-bufferSalineTween20)每IO分鐘進行3次一邊搖晃一邊洗滌，通過化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescence)進行顯影。實驗結(jié)果為如圖13所示，能夠確認lKBa蛋白質(zhì)由于姜黃素一X而明顯磷酸化。該結(jié)果間接表明iNOS、TNF-a及COX-2的增加起因于NF-kB活性。實驗例10:測定通過口服給藥姜黃素一X時的NO的生成量(體內(nèi))為了探明上述實施例1中分離的姜黃素一X的免疫調(diào)節(jié)效果和NO分泌之間的相關(guān)關(guān)系，通過動物實驗來觀察NO生成功能。將小鼠分組，每組有12只C57BL/6小鼠(17-18g，雌性)，將姜黃素—X以10、50及100mg/kg濃度每天服用一次連續(xù)服用21天。將2ml的3%的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基注入到小鼠的腹腔內(nèi)，三天后用8ml的RPMI完全培養(yǎng)基(含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、lOOpg/ml鏈霉素)洗滌腹腔內(nèi)膜，收集腹腔巨噬細胞，使其附著在用FBS涂層的器皿4小時，去除浮游細胞僅得到純的巨噬細胞，并測定其細胞數(shù)量。以5xl()s細胞/ml濃度分別取各巨噬細胞，在37"C的<:02培養(yǎng)器中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，測定培養(yǎng)上清液中的亞硝酸鹽，用格里斯試劑(0.5%的0.5%磺胺(sulfanilyamide)，0.05%的N-(l-萘基)乙二胺二鹽酸鹽/2.5。/o的H3P04)在540nm下通過酶標(biāo)儀(MicroplateReader)測定試樣的吸光度。實驗結(jié)果為如圖14所示，當(dāng)服用實施例1中得到的姜黃素一X時，能夠增加NO的生成，這意味著多糖類被小鼠吸收，顯示出了免疫調(diào)節(jié)效果。實驗例lh口服給藥姜黃素一X對吞噬功能的影響(體內(nèi))將小鼠分組，每組有12只C57BL/6小鼠(17-18g，雌性)，將姜黃素一X以10、50及100mg/kg濃度每天服用一次連續(xù)服用21天。將2ml的3°/。的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基注入到小鼠腹腔內(nèi)，三天后用8ml的RPMI完全培養(yǎng)基(含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100pg/ml鏈霉素)洗滌腹腔內(nèi)膜，收集腹腔巨噬細胞，使其附著在以FBS涂層的器皿4小時，去除浮游細胞得到純的巨噬細胞，并測定其細胞數(shù)量。以5xl()S細胞/ml濃度分別取各巨噬細胞，在37"C的002培養(yǎng)器中培養(yǎng)24小時。4小時后，分別取100pl的熱滅活的異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate、FITC)標(biāo)記的大腸桿菌生物粒子(E化/zen'cWa后，培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌巨噬細胞和細菌，然后，分別取出到100ul的臺盼蘭(TrypanBlue)中在常溫下放置一分鐘后加以去除，通過熒光發(fā)光器測定吞噬功能。實驗結(jié)果為如圖15所示，當(dāng)服用實施例1中得到的姜黃素一X時，能夠大幅增加吞噬功能，且能夠確認該數(shù)值依賴于濃度的增加而增加。這表明由印尼莪術(shù)分離的多糖類在生物體內(nèi)能夠使巨噬細胞的吞噬功能大幅增加。實驗例12:口服給藥姜黃素一X時的脾細胞增值誘導(dǎo)實驗(體內(nèi))將小鼠分組，每組有12只C57BL/6小鼠(17-18g,雌性)，將姜黃素一X以IO、50及100mg/kg濃度每天服用一次連續(xù)服用21天。21天后，為了確認脾細胞的增殖，殺死小鼠，取出脾臟，在RPMI完全培養(yǎng)基(含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100pg/ml鏈霉素)中通過蓋片玻璃使細胞流出，將流出的細胞以2xl(f細胞/ml濃度分別取至37"C的C02培養(yǎng)器，培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)結(jié)束后，添加MTT溶液(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)，然后培養(yǎng)4小時。MTT-甲臢(formazan)生成物則通過添加相同容量的溶解緩沖液(DMSO)而加以溶解。甲臢的量則利用酶標(biāo)儀(microplatereader)測定570nm下被吸収的量。實驗結(jié)果，以服用了姜黃素一X的小鼠的脾細胞對沒有服用姜黃素一X的小鼠的脾細胞的比例的形式示于表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>如表3所示，脾細胞數(shù)量的增加依賴于本發(fā)明的姜黃素一X，由于脾細胞的增加是免疫增強的指標(biāo)，因此實驗結(jié)果表明本發(fā)明的姜黃素一X具有免疫增強效果。實驗例13:測定通過口服給藥姜黃素一X的脾細胞的殺傷癌細胞的功能(體內(nèi))由于使用具有抗癌效果的抗癌劑的癌癥治療的副作用非常大，因此，最近多利用采用了免疫增強劑的癌癥治療療法，并得到了持續(xù)的開發(fā)。免疫劑的使用能夠減少抗癌劑的副作用，而且能夠增加抗癌治療效果。在上述實施例中證明了姜黃素一X在生物體內(nèi)以及生物體外具有免疫增強效果。在本實施例中則驗證姜黃素一X的免疫增強能否表現(xiàn)出抗癌效果。將小鼠分組，每組有12只C57BL/6小鼠(17-18g,雌性)，將多糖類以10、50及100mg/kg濃度每天服用一次連續(xù)服用21天。21天后，為了確認脾細胞的增殖，殺死小鼠，取出脾臟，在RPMI完全培養(yǎng)基(含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、100pg/ml鏈霉素)中通過蓋片玻璃使細胞流出，將流出的細胞以2"07細胞/1111濃度分別取至37'C的C02培養(yǎng)器中培養(yǎng)72小時。將癌細胞YAC-1細胞用顯示綠色蛍光的DiOC18(3，3'-雙十八烷基氧雜羰花青高氯酸鹽(3,3'-dioctadecyloxacarbocyanineperchlorate),MolecularProbes,Eugene,U.S.A.)來標(biāo)記。將培養(yǎng)的脾細胞和被標(biāo)記的靶細胞(YAC-1細胞)以50:1比例進行24小時的培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，投入lOpl的碘化丙啶(propidiumiodide)(PI,Sigma,U.S.A.),利用FACScan流式細胞儀(BectonDickinson,Heidelberg,German)測定脾細胞的癌細胞殺傷功能。實驗結(jié)果如圖16所示，通過口服給藥姜黃素一X而活化的脾細胞的癌細胞殺傷功能依賴于濃度的增加而增高，由此證明了姜黃素一X能夠沒有細胞毒性的增加生物體免疫，是顯示抗癌效果的抗癌免疫增強劑。實驗例14:口服給藥姜黃素一X對細胞因子的分泌的影響(體內(nèi))將小鼠分組，每組有12只C57BL/6小鼠(17-18g，雌性)，將多糖類以10、50及100mg/kg濃度每天服用一次連續(xù)服用21天。將2ml的3。/。的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基注入到小鼠腹腔內(nèi)，三天后用8ml的RPMI完全培養(yǎng)基(含有10%的胎牛血清、100units/ml的青霉素、lOOpg/ml鏈霉素)洗滌腹腔內(nèi)膜，收集腹腔巨噬細胞，使其附著在以FBS涂層的器皿4小時，去除浮游細胞得到純的巨噬細胞，并測定其細胞數(shù)量。以5xl()S細胞/ml濃度分別取各巨噬細胞，在37"的C02培養(yǎng)器中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞用PBS加以洗滌，添加lml的三唑(Invitrogen,USA)并在室溫下進行攪拌。加入20(^1的氯仿后，再次進行攪拌，在12000rpm、4'C的條件下進行15分鐘的離心分離后，在上清液中加入異丙醇再次進行離心分離，從而得到RNA顆粒。通過MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)將在此得到的RNA制作成cDNA。向其中添加iNOS(正義5'-CAACCAGTATTATGGCTCCT國3'，反義5'隱GTGACAGCCCGGTCTTTCCA畫3')、TNF-a(正義5畫CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3，反義5-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3，IL畫1(正義5-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACATC-3，反義5-GTGCTGCCTAATGTCCCCTTGAATC-3，IL-6(正義5-GATGCTACCAAACTGGATATAATC-3，反義5畫GGTCCTTAGCCACTCCTTCTGTG-3;)及(3-肌動蛋白(卩-actin)(正義5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3',反義5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3')的引物，并通過Taq聚合酶(taqpolymerase)對各基因進行增幅。此時，基因增幅是以在95。C下30秒、55"C下1分鐘、72"C下1分鐘為一循環(huán)，共重復(fù)循環(huán)30次后，最后在72'C下反應(yīng)5分鐘而進行。將所得到的RNA用瓊酯糖凝膠實施電泳，用UV檢測器進行確認。實驗結(jié)果如圖17、18、19及圖20所示，能夠確認通過多糖類iNOS、TNF-a、IL-l卩與IL-6的mRNA增加。該結(jié)果表明上述實驗例中記載的通過姜黃素一X免疫增強效果起因于mRNA表達的調(diào)節(jié)。實施例213:根據(jù)不同的提取條件從印尼莪術(shù)提取的多糖類的分離作為多糖類提取溶劑使用熱水、0.015N的NaOH、0.015N的HC1，采用與實施例l相同的方法從印尼莪術(shù)提取多糖類并進行分離精制。接著，以多糖類濃度為10嗎/ml，用與上述實驗例3和實驗例5相同的方法測定NO生成功能和巨噬細胞的吞噬功能，并示于表4中。該結(jié)果是用相對于未用試樣處理的組的百分比表示。如表5所示，根據(jù)提取條件不同能夠得到提取收率為2.18.5%、數(shù)均分子量為1100082000的免疫增強多糖類，并在所有的提取條件下都顯示出NO生成功能。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實驗例15:姜黃素一X的抗癌效果(體內(nèi))將小鼠分組，每組有10只BDF1小鼠(17-18g，雌性)，將B16F10癌細胞(5><105)移植到小鼠腹腔而誘發(fā)癌癥，從移植第二天起，將用生理鹽水稀釋成IO、50及100mg/kg濃度的多糖類每天口服投藥一次。為了確認各自實驗組等的毒性，在用試樣處理期間對小鼠測量體重，沒有發(fā)現(xiàn)體重的減少。這表明在所有的實驗群中都沒有毒性。實驗結(jié)果為，用移植癌細胞后的第60天還存活的小鼠數(shù)量來求出存活率，用相對于未用姜黃素一X處理的小鼠的存活率的比例來計算。實驗結(jié)果為如下表5所示，通過姜黃素一X的處理提高存活率，而該存活率的值依賴于濃度的增加而增加。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實驗例16:姜黃素一X對癌細胞的抗腫瘤效果(體內(nèi))將小鼠分組，每組有10只ICR小鼠(20-23g，雌性)，向小鼠腹腔皮下注射200pl的將癌細胞(sarcoma-180，肉瘤)稀釋在生理鹽水而得到的細胞溶液("106細胞)，利用該得到的固體癌模型來加以測定。24小時后，將姜黃素一X以10、50及100mg/kg的濃度每天口服給藥一次。提取給藥20天后所生成的固體癌，稱其重量。從提取的固體癌重量計算出固體癌生成的抑制率，并將其結(jié)果整理在下表6中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如表6所示，在未用試樣處理的組中固體癌重量為449士98mg，當(dāng)姜黃素—X為50禾B100mg的情況下，其固體癌重量分別為276土90mg和199士81mg，相對于對照組顯示出38.6和62.1%的固體癌的生成抑制率。工業(yè)上實用性本發(fā)明提供由印尼莪術(shù)制造有效的多糖類的方法，根據(jù)該制造方法得到的多糖類以及作為有效成分含有該多糖類的藥物組合物。本發(fā)明的多糖類及藥物組合物具有優(yōu)異的免疫增強效果以及抗癌效果。權(quán)利要求1.一種由印尼莪術(shù)分離的多糖類的制造方法，其特征在于，包括(S1)準備印尼莪術(shù)根的粉末的工序；(S2)用有機溶劑提取上述粉末后，進行過濾或離心分離而得到濾渣的工序；(S3)提取上述濾渣，從而配制含有多糖類的溶液的工序；(S4)往上述含有多糖類的溶液中添加淀粉水解酶，從而去除淀粉的工序；(S5)在上述(S4)工序后對多糖類進行沉淀的工序；及(S6)在上述(S5)工序后對多糖類進行精制的工序。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的由印尼莪術(shù)分離的多糖類的制造方法，其特征在于，上述(S3)工序的提取使用熱水、酸溶液或者堿溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的由印尼莪術(shù)分離的多糖類的制造方法，其特征在于，上述堿溶液為0.00510N的NaOH溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的由印尼莪術(shù)分離的多糖類的制造方法，其特征在于，上述酸溶液為0.00510N的HC1溶液。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的由印尼莪術(shù)分離的多糖類的制造方法，其特征在于，上述(S5)工序為在(S4)工序后添加低級醇的工序。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的由印尼莪術(shù)分離的多糖類的制造方法，其特征在于，上述(S6)工序為通過透析或者超濾去除低分子成分的工序。7.—種由印尼莪術(shù)分離的多糖類，其是通過權(quán)利要求16中任意一項所述的制造方法得到。8.—種藥物組合物，其特征在于，作為有效成分而含有權(quán)利要求7的多糖類。9.一種抗癌輔助劑組合物，其特征在于，作為有效成分而含有權(quán)利要求7的多糖類。10.—種免疫增強劑組合物，其特征在于，作為有效成分而含有權(quán)利要求7的多糖類。全文摘要本法明提供一種多糖類的制造方法、由該制造方法得到的多糖類、以及作為有效成分而含有該多糖類的藥物組合物，所述多糖類的制造方法包括(S1)準備印尼莪術(shù)根的粉末的工序；(S2)用有機溶劑提取上述粉末后，進行過濾或離心分離而得到濾渣的工序；(S3)提取上述濾渣，從而配制含有多糖類的溶液的工序；(S4)往上述含有多糖類的溶液中添加淀粉水解酶，從而去除淀粉的工序；(S5)在上述(S4)工序后對多糖類進行沉淀的工序；及(S6)在上述(S5)工序后對多糖類進行精制的工序。本發(fā)明的多糖類能夠活化巨噬細胞，可極其有效地應(yīng)用于包括癌的有關(guān)免疫性疾病的預(yù)防、治療以及用于治療后的免疫增強的藥品以及功能性食品中。文檔編號C08B37/00GK101238152SQ200680029059公開日2008年8月6日申請日期2006年6月14日優(yōu)先權(quán)日2005年6月14日發(fā)明者孫鐘熙,李仙姬,秋政翰,金我真,韓奎利,黃在寬申請人:黃在寬