一種一步酶解法生產豬血球活性小肽粉的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種一步酶解法生產豬血球活性小肽粉的制備方法，主要步驟包括采集經抗凝處理的新鮮豬血，離心分離得到血球液，經溶血、酶解、離心得到酶解液，酶解液經超濾膜過濾、納濾膜濃縮后噴霧干燥得豬血球活性小肽粉。本發(fā)明的方法選用高效內切蛋白酶，采用一步酶解法并結合超濾膜與納濾膜分離技術，工藝流程簡單，生產周期短，生產效率高，成本低，適合規(guī)?；墓I(yè)生產。本發(fā)明所制備的產品中活性小分子肽（相對分子量介于180～1000Da之間）含量高達75%以上，有機卟啉鐵（血紅素鐵）含量達到0.2%以上，灰份含量低于5.0%，游離氨基酸含量低于11%。產品能促進動物生長，增強動物免疫力和抗病能力，是一種新型的功能性蛋白質飼料原料。
【專利說明】
一種一步酶解法生產豬血球活性小肽粉的制備方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及動物血液蛋白深加工技術領域，尤其涉及一種一步酶解法生產豬血球 活性小肽粉的制備方法。
【背景技術】
[0002] 根據(jù)含氨基酸殘基數(shù)的不同，肽可以分為多肽、寡肽、小肽。一般來講，含氨基酸殘 基數(shù)超過50個的通常稱為蛋白質，低于50個大于10個氨基酸殘基的稱為多肽，低于10個氨 基酸殘基的稱為寡肽。小肽是指相對分子量介于180~1000 Da之間的二肽、三肽和四肽。大 量研究表明，在動物體內存在小肽吸收機制，小肽能完整地通過腸黏膜細胞進入體內循環(huán)。 動物67 %的氨基酸是以小肽的形式吸收的，剩余的33 %才以游離氨基酸(FAA)的形式吸收。 小肽不僅為蛋白質合成提高氮架，而且具有重要的生理調節(jié)功能。小肽的生理功能主要體 現(xiàn)在以下幾個方面：（1)促進氨基酸吸收，提高蛋白質合成速度。小肽不僅能被小腸粘膜吸 收利用，其合成蛋白質的速度也遠遠尚于氣基酸。（2)提尚礦物質的吸收利用率。在動物體 內，大多數(shù)的礦物元素吸收都要以蛋白質為載體，小肽可以與金屬離子形成螯合物，保證其 可溶狀態(tài)，從而可以促進礦物元素的被動轉運過程及其儲存。（3)提高動物機體免疫力。小 肽能夠通過誘導小腸絨毛刷狀緣膜酶活性上升和刺激消化酶分泌，抑制大腸桿菌的繁殖， 來提高機體的免疫力。（4)促進消化道的發(fā)育，減少腹瀉的發(fā)生。幼齡動物因消化道中的酶 活較低，消化能力差，當日糧中蛋白質和游離氨基酸濃度過高時，容易引起動物的腹瀉。小 肽通過誘導小腸中一些酶活性的提高，使小腸消化功能發(fā)育提前，從而促進幼小動物的健 康生長，提高其生產性能。因此，近年來功能性小肽產品的開發(fā)制備已成為保健食品和動物 營養(yǎng)領域的研究熱點。
[0003] 豬血球是從豬血全血中離心分離得到的一種富含血紅蛋白（Hemoglobin)的血細 胞，也稱紅細胞或紅血球，其血紅蛋白的含量達到36%以上，約占全血蛋白質總量80%，是一 種品質優(yōu)良的動物源性蛋白質資源。尤其值得一提的是，豬血球中還含有豐富的有機卟啉 鐵(也稱血紅素鐵），每100g血球蛋白粉中有機卟琳鐵(血紅素鐵)的含量尚達0.3克以上。有 機卟啉鐵亦即血紅素型鐵在腸道可以不受食物其他因素的影響進入腸黏膜，較其他植物性 鐵或動物性非血紅素型鐵以及無機鐵吸收率高，因此添加富含有機卟啉鐵(血紅素鐵)的血 粉是幼齡動物補鐵和預防母豬貧血極為有效的方法。
[0004] 多年來，國內豬血加工企業(yè)基本上都是將從全血中分離得到的血球液直接噴霧干 燥加工成血球蛋白粉。這種血球蛋白粉因蛋白質含量高，有機卟啉鐵含量豐富，目前在部分 畜禽和水產飼料中得到一定程度的應用。但是，由于血紅蛋白分子量大(分子量分布范圍主 要集中在10000-60000Da之間），沒有經過降解的血球蛋白粉不易被動物消化吸收，特別是 幼畜由于消化功能尚未健全、酶系統(tǒng)發(fā)育不完善，對血紅蛋白的消化能力差，利用率低，并 造成環(huán)境污染，市場接受度不高，這是制約目前血球蛋白粉在養(yǎng)殖生產特別是在斷奶仔豬 日糧中大量推廣應用的一個重要因素。另一方面，目前市場上生產銷售的血球蛋白粉基本 上都不含有活性肽類物質或者活性小分子肽含量很低，僅僅只能作為普通的蛋白質飼料原 料銷售，導致其經濟附加值不高，難以滿足當前養(yǎng)殖業(yè)對功能性飼料原料的迫切需求。
[0005] 為了解決血球中血紅蛋白大分子難以被消化吸收的問題，提升血球蛋白粉的營養(yǎng) 價值和利用效果，近年來國內一些科研工作者在改進血球液加工工藝技術方面做了許多嘗 試，并取得了一些進步，其中不少已申請了發(fā)明專利。例如，CN200610034691.2公開了一種 豬血血紅蛋白生物酶解制備低分子肽及氨基酸的方法，該方法以豬血血紅細胞為原料，通 過高壓均質或超聲波處理并結合復合蛋白酶酶解技術，制備出低分子肽和氨基酸，蛋白質 回收率高，產物無不良風味。但是，該方法所得的產品中主要成分是分子量為1000 ODa以下 的豬血紅蛋白酶解產物，其中肽的分子量分布和含量特別是功能性的小分子肽含量并不清 楚。CN201210191699.5公開了一種二步酶解法生產高品質血球蛋白肽的制備方法。該方法 以豬血紅血球為原料，利用酸性蛋白酶和中性蛋白酶進行分步酶解處理，并結合離心沉淀 和化學氧化脫色方法，去除血紅素，最終得到脫色的血球蛋白肽，產品具有良好的外觀色 澤，無臭味，產品中分子量小于5000Da的多肽類物質占80%以上。但是，該技術方法需要進行 兩步酶解處理，特別是在酸性蛋白酶水解過程中，在酸性條件下(PH2-3)部分血紅蛋白易發(fā) 生變性，并與血紅素一起沉淀，被離心分離去除，因而蛋白質回收率較低，尤其是作為動物 重要補鐵來源的有機卟啉鐵(血紅素鐵)流失，同時因多次調節(jié)PH值，帶入較多的鹽份，從而 造成制備產物中灰分含量較高，產品中活性小分子肽(相對分子量介于180~1000 Da之間） 的含量也沒有報道。CN201410547593.3公開了一種豬血球蛋白粉的制備方法，以豬血全血 為原料，通過離心分離和超聲波處理制備豬血血紅蛋白液，再依次對血紅蛋白液進行物理 脫氧、超聲處理、復合酶分段酶解、活性碳脫色、膜超濾濃縮、噴霧干燥等復雜的工藝流程處 理，最后得到乳白色的豬血球蛋白多肽粉和血紅素肽，該方法雖然徹底脫除了血球蛋白多 肽粉的顏色和血腥味，產品感官性狀大幅提升，蛋白消化吸收率有所提高，但是需要多次超 聲波處理，分段酶解，反復離心以及脫色濃縮，工藝繁瑣，成本高，所得產品是分子量在 6000Da以上的蛋白多肽粉，不含活性小分子肽，經濟附加值不高。因此，現(xiàn)有技術方案無論 是在制備工藝的簡易性與可操作性方面還是在產品的營養(yǎng)價值和功能性方面都存在不足 之處。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種一步酶解法生產豬血球活性小肽粉的制備 方法，該方法以豐富的豬血為原料，工藝簡單，成本低，易于實施，所得產品中活性小分子肽 含量高，易于消化吸收利用，能明顯提高動物的生產性能，改善動物免疫機能，以滿足市場 對功能性蛋白飼料原料的需求。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案來實現(xiàn)的：一種一步酶解法生產豬血 球活性小肽粉的制備方法，包括以下步驟： (1) 豬血球液制備:采集經抗凝處理的新鮮豬血，離心分離，收集血紅細胞，即得到血球 液； (2) 溶血:往血球液中加入其體積1-2倍的去離子水，不斷攪拌溶血30-90min，攪拌速度 為30-60r/min，得到溶血液； (3) 酶解:調節(jié)溶血液PH值至8.0-9.0，加入蛋白酶，在40-60 °C溫度下酶解4-16h，將酶 解液升溫至85°C滅酶5-10分鐘，即得到酶解液； (4) 離心:將酶解液進行高速離心，收集上清夜，去除沉淀； (5) 超濾:將收集的離心上清液經截留分子量為1000-3000Da的超濾膜裝置進行超濾， 收集透過液； (6) 納濾:將收集的超濾透過液，用截留分子量為150-300Da的納濾膜進行納濾濃縮， 收集濃縮液； (7) 噴霧干燥:將所得到的納濾濃縮液進行噴霧干燥，即得到豬血球活性小肽粉。
[0008] 上述步驟（1)中所述的抗凝處理是添加食品級檸檬酸鈉，添加量為新鮮豬血重量 的0.3-0.6%，先將稱量好的檸檬酸鈉配制成10-15%檸檬酸鈉溶液，然后在采集新鮮豬血過 程中邊攪拌邊緩慢加入檸檬酸鈉溶液。
[0009] 上述步驟（1)中所述的離心分離是采用管式離心機連續(xù)分離，離心轉速大于 10000r/min。
[0010] 上述步驟(3)所述的蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶，酶活力為180000-200000U/ml，蛋 白酶的添加量為血球液重量的0.1-1.0%。
[0011 ]上述步驟(4)所述的高速離心是采用管式離心機分離，離心轉速大于10000r/min。
[0012] 上述步驟(7)所述的噴霧干燥的進風口溫度為200-250°C，出風口溫度為70-100 cC。
[0013] 通過實施上述技術方案，本發(fā)明具有如下的有益效果： (1)本發(fā)明的方法采用從枯草桿菌中提取的內切蛋白酶，將血紅蛋白水解成最理想的 小分子肽段，水解效率高。
[0014] (2)本發(fā)明的方法采用一步酶解法并結合利用超濾與納濾膜分離技術，工藝流程 非常簡單，生產周期短，生產效率高，成本低，適合規(guī)?；墓I(yè)生產。
[0015] (3)本發(fā)明所制備的豬血球活性小肽粉產品營養(yǎng)價值高，其中活性小分子肽(相對 分子量介于180~1000 Da之間）含量高達75%以上，有機卟啉鐵(血紅素鐵)含量達到0.2%以 上，灰份含量低于5.0%，游離氨基酸含量低于11%;產品中的活性小肽、有機卟啉鐵與氨基酸 共存，協(xié)同增效，易于吸收利用。
[0016] (4)本發(fā)明所制備的豬血球活性小肽粉產品具有良好的促進動物生長、提高動物 免疫力和抗病能力的功效，可作為一種新型的功能性蛋白質飼料原料，廣泛應用于飼料工 業(yè)特別是幼畜和弱畜飼料中。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明一步酶解法生產豬血球活性小肽粉的制備方法的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但是本發(fā)明的實施方式并 不局限于此實施例表示的范圍。
[0019] 實施例1 (1)豬血球液制備:采集經抗凝處理的新鮮豬血1000L，用管式離心機連續(xù)離心分離得 到440L血球液和560L血漿液，收集血球液，血漿液經噴霧干燥制成血漿蛋白粉;抗凝處理時 添加食品級檸檬酸鈉，添加量為新鮮豬血重量的0.4%，先將稱量好的檸檬酸鈉配制成10%梓 檬酸鈉溶液，然后在采集新鮮豬血過程中邊攪拌邊緩慢加入檸檬酸鈉溶液； (2) 溶血:將血球液栗入反應罐中，加入440L的去離子水，不斷攪60min，使血球破碎，攪 拌速度為30r/min，制得溶血液880L; (3) 酶解:繼續(xù)攪拌下將溶血液加熱升溫至50°C，用NaOH溶液調節(jié)其PH值至8.5，隨后添 加血球液重量0.4%的蛋白酶(酶活力200000U/ml)，不斷攪拌，每間隔一小時檢測酶解液的 PH值，當PH值下降至8.0以下時，補堿液調PH值至8.0，保溫酶解4h后，將酶解液升溫至85 °C 滅酶10分鐘，即得到酶解液； (4) 離心:將酶解液采用管式離心機連續(xù)分離，離心轉速為16300r/min，收集離心上清 夜636L，去除沉淀； (5) 超濾:將收集的離心上清液經截留分子量為1000 Da的中空纖維超濾膜裝置，得到超 濾透過液510L; (6) 納濾:將收集的超濾透過液，再用截留分子量為200Da的納濾膜過濾濃縮，收集濃 縮液336L; (7) 噴霧干燥:將所得到的納濾濃縮液進行噴霧干燥，即得到豬血球活性小肽粉121Kg; 噴霧干燥的進風口溫度為220°C，出風口溫度為80°C。
[0020] 實施例2 (1) 豬血球液制備:采集經抗凝處理的新鮮豬血2000L，用管式離心機連續(xù)離心分離得 到850L血球液和1150L血漿液，收集血球液，血漿液經噴霧干燥制成血漿蛋白粉;抗凝處理 時添加食品級檸檬酸鈉，添加量為新鮮豬血重量的0.5%，先將稱量好的檸檬酸鈉配制成10% 檸檬酸鈉溶液，然后在采集新鮮豬血過程中邊攪拌邊緩慢加入檸檬酸鈉溶液； (2) 溶血:將血球液栗入反應罐中，加入850L的去離子水，不斷攪60min，使血球破碎，攪 拌速度為50r/min，制得溶血液1700L; (3) 酶解:繼續(xù)攪拌下將溶血液加熱升溫至55°C，用NaOH溶液調節(jié)其PH值至8.5，隨后添 加血球液重量0.3%的蛋白酶(酶活力200000U/ml)，不斷攪拌，每間隔一小時檢測酶解液的 PH值，當PH值下降至8.0以下時，補堿液調PH值至8.0，保溫酶解6h后，將酶解液升溫至85 °C 滅酶10分鐘，即得到酶解液； (4) 離心:將酶解液采用管式離心機連續(xù)分離，離心轉速為16300r/min，收集離心上清 夜1210L，去除沉淀； (5) 超濾:將收集的離心上清液經截留分子量為2000Da的中空纖維超濾膜裝置，得到超 濾透過液1045L; (6) 納濾:將收集的超濾透過液，再用截留分子量為200Da的納濾膜過濾濃縮，收集濃 縮液744L; (7) 噴霧干燥:將所得到的納濾濃縮液進行噴霧干燥，即得到豬血球活性小肽粉243Kg; 噴霧干燥的進風口溫度為230°C，出風口溫度為90°C。
[0021] 實施例3 (1)豬血球液制備:采集經抗凝處理的新鮮豬血5000L，用管式離心機連續(xù)離心分離得 到2160L血球液和2840L血漿液，收集血球液，血漿液經噴霧干燥制成血漿蛋白粉;抗凝處理 時添加食品級檸檬酸鈉，添加量為新鮮豬血重量的0.5%，先將稱量好的檸檬酸鈉配制成10% 檸檬酸鈉溶液，然后在采集新鮮豬血過程中邊攪拌邊緩慢加入檸檬酸鈉溶液； (2) 溶血:將血球液栗入反應罐中，加入22001^的去離子水，不斷攪6〇1^11，使血球破碎， 攪拌速度為50r/min，制得溶血液4360L; (3) 酶解:繼續(xù)攪拌下將溶血液加熱升溫至55°C，用NaOH溶液調節(jié)其PH值至8.5，隨后添 加血球液重量0.2%的蛋白酶(酶活力200000U/ml)，不斷攪拌，每間隔一小時檢測酶解液的 PH值，當PH值下降至8.0以下時，補堿液調PH值至8.0，保溫酶解8h后，將酶解液升溫至85 °C 滅酶10分鐘，即得到酶解液； (4) 離心:將酶解液采用管式離心機連續(xù)分離，離心轉速為16300r/min，收集離心上清 夜2850L，去除沉淀； (5) 超濾:將收集的離心上清液經截留分子量為3000Da的中空纖維超濾膜裝置，得到超 濾透過液2470L; (6) 納濾:將收集的超濾透過液，再用截留分子量為200Da的納濾膜過濾濃縮，收集濃 縮液1620L; (7) 噴霧干燥:將所得到的納濾濃縮液進行噴霧干燥，即得到豬血球活性小肽粉631Kg; 噴霧干燥的進風口溫度為230°C，出風口溫度為90°C。
[0022] 對上述實施例得到的產品主要成分以及蛋白質（肽)分子量分布與產品功效進行 檢測。
[0023] 產品主要成分檢測：按照常規(guī)方法對產品粗蛋白、小分子肽（相對分子量在180-1 OOODa)、粗灰分、水分、鐵等主要成分進行檢測。
[0024] 結果如表1: 表1豬血球活性小歎粉主要成分含:懸
從表1中可以看出，實施例所得的產品中蛋白質含量均在87%以上，小分子肽含量達到 75%以上，灰分含量小于5%，鐵含量在0.2%以上。
[0025]蛋白質(肽)分子量分布檢測:對上述實施例得到的產品取樣送江南大學分析測試 中心，采用高效凝膠過濾色譜(HPLC)法測定，以已知分子量蛋白質做參照。
[0026] 結果如表2:
從表2中可以看出，產品中相對分子量在180-1 OOODa的小肽組分占蛋白質(肽)的比例 在85%以上，分子量小于ISODa的游離氨基酸所占比例在11%以下。
[0027]功效檢測：選擇35日齡的杜X長X大三元雜交仔豬120頭，按體重相近、遺傳基礎 相似的原則，隨機分為3個處理組，分別為基礎日糧組、基礎日糧+0.5%小肽組、基礎日糧+ 1.0%小肽組，每個處理組設四個重復，每個重復10頭豬，試驗期30天。
[0028] 結果見表3: .表3豬M球活性肽粉對斷婼仔豬生產性能及愈液指櫬的影晌
從表3中可以看出，與對照組相比，添加血球活性小肽組平均日增重提高了 10.6-14.0%，腹瀉率降低34.9-40.8%;血液總蛋白、球蛋白、IgG含量分別提高了11.5-19.9%、9.4_ 23.0%、34.4-56.3%，這說明豬血球活性小肽粉能明顯促進仔豬生長發(fā)育，提高仔豬生產性 能，增強仔豬的免疫機能。
【主權項】
1. 一種一步酶解法生產豬血球活性小肽粉的制備方法，包括以下步驟： (1) 豬血球液制備：在新鮮的豬血中加入檸檬酸鈉做抗凝處理，然后離心分離，收集血 紅細胞，即得到血球液； (2) 溶血:往血球液中加入其體積1-2倍的去離子水，不斷攪拌溶血30-90min，攪拌速度 為30-60r/min，得到溶血液； (3) 酶解：調節(jié)溶血液PH值至8.0-9.0，加入蛋白酶，在40-60 °C溫度下酶解4-16h，將酶 解液升溫至85 °C滅酶5-10分鐘，得到酶解液； (4) 離心:將酶解液進行高速離心，收集上清夜，去除沉淀； (5) 超濾:將收集的離心上清液經截留分子量為1000-3000Da的超濾膜進行超濾，收集 透過液； (6) 納濾:將收集的超濾透過液，用截留分子量為150-300Da的納濾膜進行納濾濃縮， 收集濃縮液； (7 )噴霧干燥:將所得到的納濾濃縮液進行噴霧干燥，即得到豬血球活性小肽粉。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種一步酶解法生產豬血球活性小肽粉的制備方法，其特征 在于:步驟（1)所述檸檬酸鈉為食品級檸檬酸鈉，添加量為新鮮豬血重量的0.3-0.6%，先將 稱量好的檸檬酸鈉配制成10-15%梓檬酸鈉溶液，然后向新鮮豬血中邊攪拌邊緩慢加入檸檬 酸鈉溶液。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種一步酶解法生產豬血球活性小肽粉的制備方法，其特征 在于:步驟(1)所述離心分離是采用管式離心機連續(xù)分離，離心轉速大于l〇〇〇〇r/min。4. 根據(jù)權利要求1所述的一種一步酶解法生產豬血球活性小肽粉的制備方法，其特征 在于:步驟(3)所述蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶，酶活力為180000-200000U/ml，蛋白酶的添加 量為血球液重量的0.1 _1.0%。5. 根據(jù)權利要求1所述的一種一步酶解法生產豬血球活性小肽粉的制備方法，其特征 在于:步驟(4)所述高速離心是采用管式離心機分離，離心轉速大于10000r/min。6. 根據(jù)權利要求1所述的一種一步酶解法生產豬血球活性小肽粉的制備方法，其特征 在于:步驟(7)所述噴霧干燥的進風口溫度為200-250°C，出風口溫度為70-100°C。
【文檔編號】C07K14/805GK105859874SQ201610355698
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】陳石良
【申請人】陳石良