一種苯基取代的烷基胺的制備方法和純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了苯基取代的烷基胺的制備方法和純化方法。該方法包括下列步驟：(1)將灰產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得種子液；其中，所述的培養(yǎng)的時間為12h～48h；所述的培養(yǎng)的溫度為28～35℃；(2)將所述的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得含式I化合物的發(fā)酵液。本發(fā)明的制備方法原料廉價易得、制備周期短、綠色環(huán)保、工藝簡單；同時采用本發(fā)明的純化方法能夠獲得HPLC純度在90％以上的目標(biāo)化合物，純度高。
【專利說明】
一種苯基取代的烷基胺的制備方法和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種苯基取代的烷基胺的制備方法和純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物具有來源廣泛、種類多、易培養(yǎng)、次級代謝產(chǎn)物豐富且結(jié)構(gòu)新穎等特點，許 多微生物來源的化合物具有良好的生物活性，因此篩選微生物來源的天然產(chǎn)物對藥物的開 發(fā)具有極其重要的作用。臨床上的許多藥物及其先導(dǎo)化合物，往往都來源于微生物天然產(chǎn) 物。隨著技術(shù)的進(jìn)步，具有潛在藥理活性的新化合物不斷地從微生物中分離出來，如抗生素 107891 (專利公開號：CA2593801A1)、泰樂菌素（專利CN1148047A)等，均顯示出良好的生 物活性。
[0003] W02007091393A1中報道1-苯（1R，2R)-1，2, 3-三胺丙烷用于合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生 素10-A紅霉素。但是在該專利中并沒有提及1-苯（1R，2R)-1，2, 3-三胺丙烷的制備方法。 另外，該化合物的化學(xué)合成鮮有文獻(xiàn)報道，并且該化合物不易獲得，在工業(yè)上不能大規(guī)模制 備，因此，本領(lǐng)域亟需一種1-苯（1R，2R)-1，2, 3-三胺丙烷的制備方法和純化方法，以解決 上述技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有的1-苯（1R，2R)_1，2, 3-三胺丙烷不 易獲得、在工業(yè)上不能大規(guī)模制備等缺陷而提供了一種苯基取代的烷基胺的制備方法和純 化方法。本發(fā)明的制備方法原料廉價易得、制備周期短、綠色環(huán)保、工藝簡單；同時采用本發(fā) 明的純化方法能夠獲得HPLC純度在90%以上的目標(biāo)化合物，純度高。
[0005] 本發(fā)明主要是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)難題的。
[0006] 本發(fā)明提供了一種如式I所示的1-苯（1R，2R)-1，2, 3-三胺丙烷的制備方法，其 包括下列步驟：
[0007]
[0008] (1)將灰產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces griseochromogenes)接種至種子培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，得種子液；其中，所述的培養(yǎng)的時間為12h~48h ;所述的培養(yǎng)的溫度為28~35°C ;
[0009] (2)將所述的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得含式I化合物的發(fā)酵液。
[0010] 步驟（1)中，所述的灰產(chǎn)色鏈霉菌可為本領(lǐng)域常規(guī)的灰產(chǎn)色鏈霉菌，只要屬于灰 產(chǎn)色鏈霉菌屬并且在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生式I化合物，即可。所述的灰產(chǎn)色鏈霉菌較佳 地購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)保藏的菌株編號為CICC 11007的灰產(chǎn) 色鏈霉菌或中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)保藏的菌株編號為 4. 1964,分離號為LMG19891的灰產(chǎn)色鏈霉菌。上述灰產(chǎn)色鏈霉菌均可在上述保藏中心購 買得到，其網(wǎng)上購買相關(guān)的網(wǎng)頁說明和信息具體見附件1和附件2。所述的將灰產(chǎn)色鏈霉 菌接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法和條件可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件。所述的灰產(chǎn)色鏈 霉菌可以灰產(chǎn)色鏈霉菌孢子粉的形式或以灰產(chǎn)色鏈霉菌甘油水溶液的形式接種到種子培 養(yǎng)基中，本發(fā)明優(yōu)選以灰產(chǎn)色鏈霉菌甘油水溶液形式添加到種子培養(yǎng)基中。所述的灰產(chǎn)色 鏈霉菌甘油水溶液中，所述的甘油水溶液的濃度可為本領(lǐng)域常規(guī)的濃度，較佳地為15 %~ 50%，所述的百分比（％)是指甘油的質(zhì)量（g)與水的體積（L)之間的百分比，即50%的甘 油水溶液一般是指1L甘油水溶液中含有50g甘油，即50g/L的甘油水溶液。所述的灰產(chǎn) 色鏈霉菌甘油水溶液中，所述的灰產(chǎn)色鏈霉菌的活菌數(shù)較佳地為1X 10s~5X 10 9/mL。所 述的灰產(chǎn)色鏈霉菌甘油水溶液與種子培養(yǎng)基的體積比可為本領(lǐng)域常規(guī)的體積比，較佳地為 1:50~1:250 ;更佳地為1:100。所述的培養(yǎng)的溫度較佳地為30°C。所述的培養(yǎng)的振蕩速 度較佳地為200~250r/min，更佳地為220r/min。所述的培養(yǎng)的時間較佳地為24h。
[0011] 步驟（1)中，所述的種子培養(yǎng)基可為本領(lǐng)域灰產(chǎn)色鏈霉菌培養(yǎng)常規(guī)的種子培養(yǎng) 基，較佳地，所述的種子培養(yǎng)基包括酵母提取物3g/L~5g/L、麥芽提取物8g/L~15g/L和 葡萄糖3g/L~5g/L，其中，g/L是指各組分與種子培養(yǎng)的質(zhì)量體積比；更佳地，所述的種子 培養(yǎng)基包括酵母提取物4g/L、麥芽提取物10g/L和葡萄糖4g/L。
[0012] 步驟⑵中，所述的將所述的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法和條件可為 本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件。所述的種子液與所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比較佳地為1:100~ 1:150 ;所述的培養(yǎng)的溫度較佳地為28~35°C，更佳地為30°C。所述的培養(yǎng)的振蕩速度較 佳地為200~250r/min，更佳地為220r/min。所述的培養(yǎng)的時間較佳地為144~192h。
[0013] 步驟（2)中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基可為本領(lǐng)域灰產(chǎn)色鏈霉菌種子液發(fā)酵培養(yǎng)常規(guī)的 發(fā)酵培養(yǎng)基，較佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括NaCl lg/L~1. 5g/L、K2HP040 . 8~1. 2g/L、可 溶性淀粉 10 ~15g/L、蛋白胨 2g/L ~3g/L、CaC032g/L ~3g/L、（NH4)S042g/L ~3g/L、無 機鹽溶液〇· 8mL/L~L 2mL/L、MgS04 · 7H20 2g/L~3g/L和水(λ 8~L 2L ;所述的發(fā)酵培 養(yǎng)基中，g/L是指各組分與發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比；mL/L是指各組分與發(fā)酵培養(yǎng)基的體 積比；所述的無機鹽溶液包括 FeS04 · 7H20 lg/L ~1. 2g/L、ZnS04 · 7H20 lg/L ~1. 2g/L、 MgCl2 ·6Η2〇]^/1~1. 2g/L和水0. 8~1. 2L ;所述的無機鹽溶液中，g/L是指各組分與無機 鹽溶液的質(zhì)量體積比。更佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括NaCl lg/L、K2HP04lg/L、可溶性淀粉 l〇g/L、蛋白胨 2g/L、CaC032g/L、（NH4)S042g/L、無機鹽溶液 lmL/L、MgS04 · 7H20 2g 和水；所 述的無機鹽溶液包括 FeS04 · 7H20 lg/L、ZnS04 · 7H20 lg/L、MgCl2 · 6H20 lg/L 和水。所述 的發(fā)酵培養(yǎng)基和所述的無機鹽溶液的pH值較佳地為7. 2~7. 4。
[0014] 步驟（2)得到含式I化合物的發(fā)酵液后，還可進(jìn)一步包括后處理的操作。所述的 后處理的方法和條件可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件，較佳地包括下列步驟：將步驟（2)得 到的含式I化合物的發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，得到的沉淀與酮類溶劑混合，超聲，再進(jìn)行離心 處理，得到上清液，除去酮類溶劑，即得式I化合物粗品。其中，所述的離心的速度較佳地 為3500~5000r/min ;更佳地為4000r/min。所述的離心的時間較佳地為20~40min ;更 佳地為30min。所述的超聲的方法和條件可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件，較佳地為在40~ 70kHZ (優(yōu)選42kHZ)處理10~60min (優(yōu)選40min)。所述的超聲的次數(shù)不作具體限定，一般 為2~3次。所述的酮類溶劑可為本領(lǐng)域常規(guī)的酮類溶劑，較佳地為丙酮。所述的酮類溶劑 的用量不作具體限定，所述的酮類溶劑與含式I化合物的發(fā)酵液的體積比較佳地為1:1~ 1:3,更佳地為1: 2。所述的除去酮類溶劑的方法可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，較佳地為減壓濃 縮。所述的減壓濃縮的溫度較佳地為40~45°C。所述的減壓濃縮的真空度較佳地為700~ 800mmHg 更佳地為 758mmHg。
[0015] 所述的后處理結(jié)束后，還可進(jìn)一步包含純化的操作。所述的純化的方法和條件可 為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件，本發(fā)明優(yōu)選下列方法和條件：
[0016] (1)將所述的式I化合物粗品采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；洗脫液依次為 水、10%、20%、30%、40%、60%、80%和100%的甲醇-水混合液，所述的百分比（％)是指 甲醇的體積與水的體積比；收集30%的甲醇-水混合液的洗脫液，濃縮，得濃縮物A ;
[0017] (2)將所述的濃縮物A采用制備液相色譜進(jìn)行分離純化；流動相為20%的甲 醇-水混合液，所述的百分比（％)是指甲醇的體積與水的體積比；收集含式I化合物的洗 脫液，濃縮，得濃縮物B ;
[0018] (3)將所述的濃縮物B采用制備液相色譜進(jìn)行分離純化；流動相為水，收集含式I 化合物的洗脫液，濃縮，得濃縮物C ;
[0019] (4)將所述的濃縮物C采用制備液相色譜進(jìn)行分離純化；流動相為20%的甲 醇-水混合液，所述的百分比（％)是指甲醇的體積與水的體積比；收集含式I化合物的洗 脫液，濃縮，得式I化合物產(chǎn)品。
[0020] 步驟（1)中，所述的反相硅膠層析中的層析柱可為本領(lǐng)域常規(guī)的層析柱，一般根 據(jù)含式I化合物的粗品的質(zhì)量進(jìn)行常規(guī)選擇。其中，所述的層析柱一般以十八烷基硅烷鍵 合硅膠（〇DS_C ls)為填充劑。所述的十八烷基硅烷鍵合硅膠市售可得，較佳地為YMC公司生 產(chǎn)的批號為9955的0DS-C ls。所述的0DS-Cls與所述的式I化合物的粗品的質(zhì)量比可按照 本領(lǐng)域常規(guī)進(jìn)行選擇，較佳地為1. 5:1~3. 0:1 ;更佳地為2. 5:1。較佳地，所述的水、10%、 20%、30%、40%、60%、80%和100%的甲醇-水混合液與所述的含式1化合物的粗品的體 積質(zhì)量比分別為30mL/g~35mL/g。
[0021] 步驟（2)~（4)中，所述的制備液相中，除流動相外，其他色譜條件可為本領(lǐng)域常 規(guī)的色譜條件，本發(fā)明優(yōu)選下列色譜條件：制備液相色譜儀可為本領(lǐng)域常規(guī)的制備液相色 譜儀，較佳地為島津公司型號為LC20AP的制備液相色譜儀。層析柱可為本領(lǐng)域常規(guī)的層析 柱，較佳地為反相硅膠層析柱，其固定相一般為十八烷基鍵合硅膠。層析柱可為本領(lǐng)域常規(guī) 的層析柱，較佳地為 Ultimate AQ_C1S層析柱（14 X 150mm，5 μ m 或者 14 X 250mm，10 μ m)。柱 溫可為本領(lǐng)域常規(guī)的柱溫，較佳地為35~45°C (優(yōu)選40°C)。檢測波長一般為210nm。流 速一般為lmL/min~4mL/min。進(jìn)樣體積一般為10uL~400uL，較佳地為10uL~20uL。
[0022] 步驟⑴~⑷中，所述的濃縮的方法和條件可為本領(lǐng)域濃縮常規(guī)的方法和條 件，只要能除去相應(yīng)地洗脫液，即可，較佳地為減壓濃縮。所述的減壓濃縮的溫度較佳地為 40°C~45°C。所述的減壓濃縮的真空度較佳地為700~800mmHg，更佳地為758mmHg。
[0023] 本發(fā)明中，所述的水是指純水，即去離子水。
[0024] 本發(fā)明中，室溫是指10~30°C。
[0025] 在不違背本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳 實例。
[0026] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0027] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：
[0028] 本發(fā)明的制備方法原料廉價易得、制備周期短、更加綠色環(huán)保、工藝簡單。并且本 發(fā)明的純化方法能夠獲得HPLC純度在90%以上的目標(biāo)化合物，純度高。
【附圖說明】
[0029] 圖1為實施例1含式I化合物的發(fā)酵液制備的流程圖。
[0030] 圖2為實施例3對含式I化合物的粗品進(jìn)行分離純化的流程圖。
【具體實施方式】
[0031] 下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0032] 下述實施例中灰產(chǎn)色鏈霉菌購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)菌株 編號為CICC 11007的灰產(chǎn)色鏈霉菌或中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)保藏的菌株編號為4. 1964,分離號為LMG19891的灰產(chǎn)色鏈霉菌。橄欖色鏈霉菌 (Streptomyces olivaceus)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)菌株編號為 CICC 11009的橄欖色鏈霉菌。制備用硅膠層析柱廠商：月旭材料科技（上海）有限公司， 規(guī)格：250X 15mm。制備液相色譜儀生產(chǎn)廠家：島津，型號：LC20AP。
[0033] 實施例1
[0034] (1)將保藏在甘油管（50%的甘油）中的灰產(chǎn)色鏈霉菌500 μ L (中國工業(yè)微生物 菌種保藏管理中心（CICC)菌株編號為CICC 11007的灰產(chǎn)色鏈霉菌，其中灰產(chǎn)色鏈霉菌活 菌數(shù)為5 X l〇7mL)接種至含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角搖瓶中，30°C，220r/min振蕩培 養(yǎng)24h，作為種子液；種子培養(yǎng)基：酵母提取物4g/L，麥芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L。
[0035] (2)接種lmL的種子液至750mL的三角搖瓶（含100mL發(fā)酵培養(yǎng)基）中，30°C， 220r/min的條件下培養(yǎng)168h ;即得含式I化合物的發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl lg/L， K2HP04lg/L，可溶性淀粉 10g/L，蛋白胨 2g/L，CaC032g/L，（NH4)S042g/L，無機鹽溶液 lmL/L， MgS04 · 7H20 2g，水，pH 7· 2。無機鹽溶液配方為：FeS04 · 7H20 lg/L，ZnS04 · 7H20 lg/L， MgCl2 · 6H20 lg/L，水，pH 7. 2。
[0036] 流程圖具體見圖1，共富集30L灰產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵液。
[0037] 實施例2
[0038] 富集得到30L灰產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵液后，4000r/min離心30min，棄去上清，加入15L 丙酮浸泡菌體，輔以超聲（42kHZ)處理40min(反復(fù)三次超聲處理h^OOr/min離心30min， 取上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40~45°C，真空度758mmHg)至干，得到含式I化合物的粗品（即灰產(chǎn)色 鏈霉菌菌體的丙酮萃取組分），共32g，灰產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵液后處理過程如圖1所示。
[0039] 實施例3
[0040] (1)將實施例2得到的含式I化合物的粗品，用40mL無水乙醇溶解，采用反相硅膠 柱層析（8(^，005-(： 18)(￥]\?：公司，批號：9955)依次用水、10%、20%、30%、40%、60%、80%、 100%甲醇-水混合液洗脫，流速10mL/min，每個梯度用1L洗脫液洗脫，將30%甲醇洗脫液 減壓濃縮至干，得濃縮物A，低溫（-4°C )保存，備用；
[0041] (2)將所述的濃縮物A采用制備液相進(jìn)行分離純化，制備液相的色譜分析條件如 下：層析柱：Ultimate AQ-C1S(5 μπι, 14X 150mm)，檢測波長：210nm，流動相：甲醇-水混合 液，流速：lmL/min，柱溫：40°C，進(jìn)樣：10 μ L，洗脫液：20 %甲醇-水混合液。式I化合物的 出峰時間：3. 67min。收集含式I化合物的洗脫液，減壓濃縮至干，得濃縮物Β ;
[0042] (3)將所述的濃縮物B用10mL純水溶解，采用制備液相分離純化，制備液相的色譜 分析條件如下：層析柱：Ultimate AQ-Cls(10ym, 14X250mm)，檢測波長：210nm，流動相：甲 醇-水混合液，流速：4mL/min，柱溫：40°C，進(jìn)樣：400 μ L。洗脫濃度：0%甲醇。式I化合物 的出峰時間：5min ;收集含式I化合物的洗脫液，減壓濃縮至干，得濃縮物C ;
[0043] (4)將所述的濃縮物C用純水溶解，再次采用制備液相分離；制備液相的色譜分析 條件如下：層析柱：Ultimate AQ-Cls(5ym, 14X 150mm)，檢測波長：210nm，流動相：甲醇-水 混合液，流速：lmL/min，柱溫：40°C，進(jìn)樣：20 μ L。洗脫液：20%甲醇-水混合液。式I化合物 的出峰時間：4min。收集含式I化合物的洗脫液，減壓濃縮至干，得式I化合物產(chǎn)品4. 7mg。 分離純化的流程圖具體見圖2。
[0044] 式I化合物：白色粉末，可溶于甲醇，DMS0,水。HPLC純度為92. 3 %。核磁共振譜 數(shù)據(jù)如下：ESI-MS m/z:188[M-Na]+。計算分子量為 165。iH-NMRGOOMHzAOWD) δ :7.24-7 ? 35 (m，5H)，δ 3· 7-4. 6 (m，2H)，δ 2· 96-3. 02 (m，2H)，δ 1· 32 (s，1H) · 13C-NMR 137. 4 (C-4)，13 0· 4 (C-6, C-8)，129. 9 (C-5, C-9)，128. 3 (C-7)，49. 6 (C-l)，57. 8 (C-2)，38. 4 (C-3)。
[0045] 實施例4
[0046] 將實施例1中的培養(yǎng)時間縮短為144h，灰產(chǎn)色鏈霉菌替換為中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心（CGMCC)保藏的菌株編號為4. 196,分離號為LMG19891的灰產(chǎn) 色鏈霉菌，其余培養(yǎng)條件與實施例1 一致，按照實施例2、實施例3的分離步驟進(jìn)行分離，最 終獲得式I化合物產(chǎn)品4. 2mg，HPLC純度為92. 1% ;其理化性質(zhì)及核磁共振波譜同實施例 3〇
[0047] 實施例5
[0048] 將實施例1中的培養(yǎng)時間延長為192h，其余培養(yǎng)條件與實施例1 一致，按照實施例 2、實施例3進(jìn)行分離純化，最終獲得式I化合物產(chǎn)品5mg，HPLC純度為93. 0% ;其理化性質(zhì) 及核磁共振波譜同實施例3。
[0049] 對比實施例1
[0050] 將實施例1中的灰產(chǎn)色鏈霉菌替換為橄欖色鏈霉菌（Streptomyces olivaceus)， 其余操作均與實施例1相同，獲得的發(fā)酵液中沒有式I化合物。說明橄欖色鏈霉菌發(fā)酵培 養(yǎng)過程中不能產(chǎn)生式I化合物。
[0051] 對比實施例2
[0052] 將實施例1中的種子培養(yǎng)基220r/min振蕩培養(yǎng)72h，其余培養(yǎng)條件與實施例1 一 致，按照實施例2、實施例3的分離步驟進(jìn)行分離，最終未能獲得式I化合物，有可能是因為 種子老化，導(dǎo)致接種到新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基上后菌株錯過最優(yōu)次級代謝發(fā)酵時間，因此不產(chǎn) 生式I化合物。
[0053] 對比實施例3
[0054] 種子培養(yǎng)基25°C培養(yǎng)，220r/min振蕩培養(yǎng)24h，其余條件與實施例1 一致，照實施 例2、實施例3的分離步驟進(jìn)行分離，最終未能獲得式I化合物，培養(yǎng)溫度低于28°C，灰產(chǎn)色 鏈霉菌生長緩慢，種子培養(yǎng)基濃度過低，活力過差。
【主權(quán)項】
1. 一種如式I所示的I-苯（IR, 2R)-1，2, 3-=胺丙烷的制備方法，其特征在于，其包括 下列步驟：(1) 將灰產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces griseoc虹omogenes)接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 得種子液；其中，所述的培養(yǎng)的時間為12h~4她；所述的培養(yǎng)的溫度為28~35°C ; (2) 將所述的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得含式I化合物的發(fā)酵液。2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述的灰產(chǎn)色鏈霉菌為 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、保藏的菌株編號為CICC 11007的灰產(chǎn)色鏈霉菌 或中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、保藏的菌株編號為4. 1964,分離號為 LMG19891的灰產(chǎn)色鏈霉菌。3. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述的灰產(chǎn)色鏈霉菌W灰 產(chǎn)色鏈霉菌抱子粉的形式或W灰產(chǎn)色鏈霉菌甘油水溶液的形式接種到種子培養(yǎng)基中；所述 的灰產(chǎn)色鏈霉菌甘油水溶液中，所述的甘油水溶液是指質(zhì)量濃度為15%~50%的甘油水 溶液，所述的百分比是指甘油的質(zhì)量與水的體積之間的百分比，用g/L表示；所述的灰產(chǎn)色 鏈霉菌甘油水溶液中，所述的灰產(chǎn)色鏈霉菌的活菌數(shù)為1 X 1〇8~5 X 10 7mL ;所述的灰產(chǎn)色 鏈霉菌甘油水溶液與種子培養(yǎng)基的體積比為1:50~1:250。4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于， 步驟（1)中，所述的培養(yǎng)的溫度為30°C;所述的培養(yǎng)的振蕩速度為200~25化/min ;所 述的培養(yǎng)的時間為24h ; 和/或，步驟（2)中，所述的種子液與所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:100~1:150 ; 所述的培養(yǎng)的溫度為28~35°C;所述的培養(yǎng)的振蕩速度為200~25化/min ;所述的培養(yǎng)的 時間為144~19化。5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于， 步驟（1)中，所述的種子培養(yǎng)基包括酵母提取物3g/L~5g/L、麥芽提取物8g/L~15g/ L和葡萄糖3g/L~5g/l，其中，g/L是指各組分與種子培養(yǎng)的質(zhì)量體積比； 和/或，步驟似中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括化Cl Ig/L~1. 5g/L、K2HP〇4〇. 8~1. 2g/ L可溶性淀粉 10 ~15g/l、蛋白腺 2g/L ~3g/L、CaC〇32g/L ~3g/L、（NH4)S〇42g/L ~3g/L、 無機鹽溶液0. 8血/L~I. 2血/1、1拆〇4 ? 7&0 2g/L~3g/L和水0. 8~I.化；所述的發(fā)酵 培養(yǎng)基中，g/L是指各組分與發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比；mL/L是指各組分與發(fā)酵培養(yǎng)基的 體積比；所述的無機鹽溶液包括化S〇4 ? 7&0 Ig/L~1. 2g/L、ZnS〇4 ? 7&0 Ig/L~1. 2g/L、 MgClz 'SHsOlg/L~1. 2g/L和水0. 8~1. 2L ;所述的無機鹽溶液中，g/L是指各組分與無機 鹽溶液的質(zhì)量體積比；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基和所述的無機鹽溶液的抑值為7. 2~7. 4。6. 如權(quán)利要求1~5任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟似得到含式I化合 物的發(fā)酵液后，還進(jìn)一步包括后處理的操作；所述的后處理包括下列步驟：將步驟（2)得到 的含式I化合物的發(fā)酵液進(jìn)行離屯、處理，得到的沉淀與酬類溶劑混合，超聲，再進(jìn)行離屯、處 理，得到上清液，除去酬類溶劑，即得式I化合物粗品。7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的離屯、的速度為3500~5000r/ min ;所述的離屯、的時間為20~40min ;所述的超聲為：在40~70kHZ下處理10~60min ; 所述的超聲的次數(shù)為2~3次；所述的酬類溶劑為丙酬；和/或，所述的酬類溶劑與含式I 化合物的發(fā)酵液的體積比為1:1~1:3。8. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的后處理結(jié)束后，還進(jìn)一步包含純 化的操作；所述的純化的方法包括下列步驟： (1) 將所述的式I化合物粗品采用反相硅膠柱層析進(jìn)行分離純化；洗脫液依次為水、 10%、20%、30%、40%、60%、80%和100%的甲醇-水混合液，所述的百分比是指甲醇的體 積與水的體積比；收集30%的甲醇-水混合液的洗脫液，濃縮，得濃縮物A ; (2) 將所述的濃縮物A采用制備液相色譜進(jìn)行分離純化；流動相為20%的甲醇-水混 合液，所述的百分比是指甲醇的體積與水的體積比；收集含式I化合物的洗脫液，濃縮，得 濃縮物B ; (3) 將所述的濃縮物B采用制備液相色譜進(jìn)行分離純化；流動相為水，收集含式I化合 物的洗脫液，濃縮，得濃縮物C ; (4) 將所述的濃縮物C采用制備液相色譜進(jìn)行分離純化；流動相為20%的甲醇-水混 合液，所述的百分比是指甲醇的體積與水的體積比；收集含式I化合物的洗脫液，濃縮，得 式I化合物產(chǎn)品。9. 如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述的水、10%、20%、 30 %、40 %、60 %、80 %和100 %的甲醇-水混合液與所述的含式I化合物的粗品的體積質(zhì)量 比分別為30血/g~35血/邑。10. 如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)~（4)中，所述的制備液相的 色譜條件為：層析柱為反相硅膠層析柱；所述的反相硅膠層析柱固定相為十八烷基鍵合娃 膠；柱溫為35~45°C;檢測波長為210皿；流速為1血/min~4mL/min ;進(jìn)樣體積為IOuL~ 400uL〇
【文檔編號】C12P13/00GK105985991SQ201510072702
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月11日
【發(fā)明人】朱寶泉, 范必成, 林軍, 胡海峰, 周斌
【申請人】上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院