一種微通道陣列板的制備方法、用其來獲得液滴的裝置和液滴產(chǎn)生方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種微通道陣列板的制備方法，包括以下步驟：(1)取兩種不同的光纖玻璃棒，其中一種不能被腐蝕液腐蝕，一種能夠被腐蝕液腐蝕，將二者緊密排列，在高溫下融化為一個整體，經(jīng)過一次或多次拉制為長而細的玻璃棒，將拉細的玻璃棒切割為小片，得到微通道板毛坯；(2)對毛胚進行腐蝕除去芯料，得到帶通孔的微通道板；(3)對微通道板進行疏水處理。使用本發(fā)明的微通道陣列板與收集裝置和加速度產(chǎn)生裝置配合能夠利用慣性力高通量快速產(chǎn)生均勻的微米級液滴。
【專利說明】
一種微通道陣列板的制備方法、用其來獲得液滴的裝置和液 滴產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種微通道陣列板的制備方法、用其來獲得液滴的裝置和液滴產(chǎn)生方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳液液滴技術(shù)是許多分子生物學實驗中至關(guān)重要的一部分。均勻、穩(wěn)定且能夠兼 容生物學實驗的液滴已經(jīng)在很多的技術(shù)和應(yīng)用中體現(xiàn)。其中常見的有細胞培養(yǎng)、樣品分離、 數(shù)字聚合酶鏈式反應(yīng)和乳液全基因組擴增等技術(shù)和方法。液滴技術(shù)很有可能成為下一代測 序、第三代PCR反應(yīng)和相關(guān)的高通量生物測試的技術(shù)基石。由液滴造成的許多隔離獨立的溶 液環(huán)境一方面可以形成許多的微小反應(yīng)容器，將樣品的用量大大減??；一方面也可以通過 擴增的手段，數(shù)字化的檢測含量極低的樣本，是單分子擴增反應(yīng)極佳的選擇。
[0003] 目前常見的油包水液滴產(chǎn)生的方法多是利用微流控芯片，然而此方法成本高，費 時耗力，容易在實驗室中造成樣品污染。同時，微流控的方法要求良好的潔凈環(huán)境，還需要 精確的壓力控制系統(tǒng)。即使將硬件和實驗環(huán)境問題克服掉，微流控的方法將需要長時間的 調(diào)試和摸索。這些缺點使得在生物分析化學實驗室中常見的微流控裝置難以得到更廣泛的 應(yīng)用。針對上述問題，cnl04741158A提出了一種利用慣性力產(chǎn)生微液滴的裝置和方法，但該 裝置中使用毛細管陣列作為液滴化裝置，毛細管陣列需拉制而成，成功率低，毛細管粗細不 勻，易發(fā)生堵塞，實驗平行性差，難以實現(xiàn)高通量生產(chǎn)。針對毛細管陣列的缺點，本發(fā)明提出 一種微通道陣列板的制備方法以及用其來獲得液滴的裝置和液滴產(chǎn)生方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一方面在于提供一種微通道陣列板的制備方法。
[0005] -種微通道陣列板的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：（1)取兩種不同的光 纖玻璃棒，其中一種不能被腐蝕液腐蝕，一種能夠被腐蝕液腐蝕，將二者緊密排列，在高溫 下融化為一個整體，經(jīng)過一次或多次拉制為長而細的玻璃棒，將拉細的玻璃棒切割為小片， 得到微通道板毛坯；（2)對毛胚進行腐蝕除去芯料，得到帶通孔的微通道板；（3)對微通道板 進行疏水處理。
[0006]微通道陣列板的原料是光纖玻璃。玻璃中摻有鍺、硼，鋇，鑭，鎵，銻等元素，具有易 熱加工的特點。取兩種不同的光纖玻璃，其中一種是不能在稀硝酸中被腐蝕的普通光纖玻 璃，一種是可以被稀硝酸腐蝕的玻璃(稱之為芯料）。兩種玻璃都是正六邊形或正方形的邊 棒狀或者纖維狀，然后緊密的六方或者四方排列在一起。之后，在高溫下，玻璃棒融化在一 起成為一個整體。然后這個整體繼續(xù)在高溫下，經(jīng)過一次或多次拉制，成為極長但是極細的 玻璃棒（即細絲），對邊距離在4到6mm。在細絲排布的過程中有一次拉絲、兩次拉絲甚至多次 拉絲的辦法，通常情況下采用一次拉絲。一次拉絲的辦法只有一次絲排列，其中大部分的玻 璃光纖絲/棒是不能被酸腐蝕的摻雜玻璃，而少部分的絲能夠完全或者其內(nèi)芯能夠在酸性 環(huán)境下被腐蝕掉。這些絲可以是正六邊形或者正方形的柱體，分別以六方或者四方排列成 一個拼合玻璃棒，其中六方排列更常見。拼合玻璃棒在兩端有外力牽引的情況下，在800到 3000攝氏度的條件下彼此融合成一個整體后在外力牽引下成為玻璃細棒或者細絲。二次拉 絲則是重復(fù)以上拉絲步驟，將拉成的玻璃細棒或者細絲再次排列后拉絲。將拉制好的合適 粗細的玻璃細棒切割打磨后得到玻璃片便可以成為微通道板的原料。將拉細的玻璃棒切割 成1mm左右的小片，此后多次拋光，得到微通道板毛坯。
[0007] 得到的毛坯要通過腐蝕才能得到通孔。腐蝕可采取兩種種辦法，硝酸腐蝕和酸堿 交替腐蝕。若采用硝酸腐蝕，硝酸的濃度不超過lmol/L，其中0.3~0.5mol/L為宜;過程第一 步，需將玻璃板放在稀硝酸中密封，在超聲清洗儀中超聲震蕩40min以上，一般采用 a. 80kHz、b. 45kHz、c. 80kHz和45kHz 10分鐘交替，三種方法其一;其中以c方案效果最佳。腐 蝕時間一般在20~200hr，對于大多數(shù)芯料，lOOhr可以得到腐蝕完全的通孔。酸堿交替的腐 蝕辦法中，將毛坯在上述的硝酸溶液中浸泡1個小時后再在0.5mol/L燒堿浸泡一小時，反復(fù) 交替5次以內(nèi)可以得到通孔，此過程中采用超聲震蕩有助于腐蝕。其中使用的硝酸是金屬氧 化半導體純凈級別(M0S級），燒堿是分析純級別，采用MilliQ超純水稀釋，腐蝕液中可以摻 入少量氟咼子。
[0008] 微通道陣列板的制備過程如圖1所示。其中圖A為兩種不同的六邊形光纖玻璃拼接 成一個六邊形的棒狀物，其中無色玻璃為普通玻璃，不能在稀硝酸存在下被腐蝕，而黑色的 玻璃能夠在稀硝酸存在下被腐蝕;B.拼接而成的六邊形在高溫下熔成一個整體;C.熔在一 起的玻璃棒在高溫下被拉長，成為很長很細的玻璃棒，但仍然保持六邊形的結(jié)構(gòu);D.細長的 玻璃棒被切割成1~2mm的薄片，隨后經(jīng)過多次打磨，得到光滑的表面:E.經(jīng)過硝酸腐蝕之 后，玻璃薄片中的芯料被腐蝕掉，留下均勻的孔洞。圖中孔數(shù)不代表真實情況。一般情況下， 孔洞的出口需要光滑平整，這是形成大小均勻的液滴的關(guān)鍵。
[0009] -般情況下玻璃表面的具有一些硅氧鍵和硅羥基，這些基團是親水的。由于這些 親水基團的存在，水以及水溶液會在玻璃的表面鋪展開來，從而與玻璃的表面具有一定的 接觸面積。而為了使從微通道出來的水具有球形的表面從而順利的脫離，同時使得每次脫 落的液滴大小一致，就必須排除水或者水溶液與玻璃表面浸潤的影響，這就需要對微通道 板進行疏水處理。同時除了不能浸潤之外，由于本發(fā)明多用于生物應(yīng)用，要求表面不會吸 附、粘附如核酸和蛋白等物質(zhì)，因此優(yōu)選使用氟基的疏水試劑，優(yōu)選氟代烷烴，更優(yōu)選氟代 硅烷對玻璃做表面修飾。氟代烷烴不親水不親油，能夠保證較好的疏水性，同時對生物大分 子的親和性很差，可以極大的降低生物樣品的吸附，并且容易清潔:在簡單的清洗之后便可 以反復(fù)使用，基本沒有二次污染。氟基硅烷的另外一個優(yōu)點是用量少，用很少的量就可以滿 足疏水性能的要求。微通道板的疏水表面是液滴有規(guī)律懸吊斷裂的關(guān)鍵之一。為了讓一般 親水的玻璃表面具有可觀的疏水效果，一般采用化學氣相沉積法對玻璃表面進行修飾。修 飾的步驟大致包括濃硫酸雙氧水清洗，超純水清洗，干燥，氧自由基表面活化，化學氣相熏 蒸，老化和超純水后清洗等步驟。除了氣相熏蒸之外，還可以通過浸泡的方法，其步驟大致 包括清洗，氧自由基活化，浸泡，老化，后清洗等。
[0010]具體的疏水處理步驟如下：
[0011] 1.清洗
[0012]清洗的目的在于嚴格除去微通道板上的有機殘留物和無機鹽殘留物，為均勻的化 學沉積提供保障。
[0013] a)超聲酸洗
[0014] 配制25 %的濃硫酸的30 %雙氧水溶液。將約15mL30 %雙氧水倒入50mL離心管后用 滴管逐滴加入濃硫酸，在滴加的同時不停的輕輕的震蕩離心管，讓濃硫酸迅速與雙氧水混 合，同時讓產(chǎn)生的熱量擴散開來。加到離心管顯示的20mL處時，停止滴加，在震蕩過程過要 防止液體飛濺，建議在通風櫥中進行。
[0015] 配制好上述洗液后逐個用鑷子將微通道微通道板輕輕放入離心管中，每次不宜超 過10片，以防止在下一步的超聲過程中微陣列板相互碰撞過于激烈造成表面刮痕。后將離 心管的蓋子旋緊后，放在超聲清洗儀中，采用自動模式，即在80kHz和45kHz中交替，周期為 l〇s。清洗lOmin。也可以將上述配置好的濃硫酸雙氧水溶液分裝在1.5mL離心管中，其中加 入lmL左右濃酸洗液和一個微通道板后按下蓋子關(guān)緊即可。這樣分裝的效果可以從根本上 避免微通道板之間的碰撞。
[0016] b)水洗干燥
[0017] 要用超純水洗去濃酸洗液。在超聲過的離心管中加入超純水，然后倒掉。在倒水的 時候要防止玻璃薄片隨水流倒出。這樣用超純水反復(fù)傾析5次后，將玻璃薄片轉(zhuǎn)移至小玻璃 瓶中，為接下來的烘干做準備。將裝有玻璃薄片的玻璃小瓶放入真空干燥箱中。在抽真空的 條件下加熱烘干，一般設(shè)置溫度70°C，至少半個小時。
[0018] 2.氧自由基活化和氣相熏蒸
[0019] 將PVC藍色膠膜(簡稱藍膜)剪出一小塊，將微通道板逐個側(cè)放在藍膜上，保證微通 道板之間不會接觸。將粘有微通道微通道通道板的藍膜放在一個干凈的載玻片上，后將載 玻片放入氧自由基清洗儀，在抽真空后開動5min，80 %以上功率。
[0020] 在等待5min的過程中，取一只小離心管，加入不少于200μ1氟代硅烷，然后將此小 離心管放在一個小型真空干燥器中。待活化結(jié)束后將載玻片連同上面的藍膜和微通道板放 入上述真空干燥器中，打開小離心管蓋子后迅速關(guān)上干燥器蓋子。對真空干燥器超真空 3min后關(guān)閉真空閥。在常溫下熏蒸50min到lhr。
[0021] 其中使用的氟代硅烷可以是三甲基氯硅烷，三全氟甲基氯硅烷，三甲氧基丙基硅 烷，三甲氧基1H，1H，2H，2H-全氟辛基硅烷，丙基三氯硅烷，1H，1H，2H，2H-全氟辛基三氯硅 烷，（2，4-二氟苯基乙炔基)三甲基硅烷，（3，5-二氟苯基乙炔基)三甲基硅烷，（3，5-雙(三氟 甲基)苯乙炔基)三甲基硅烷，三乙基(三氟甲基)硅烷，三乙氧基[4-(三氟甲基)苯基]硅烷， 氯二甲基(五氟苯基)硅烷，111，1!1，2!1，2!1-全氟辛基三氯硅烷，1!1，1!1，2!1，2!1-全氟辛基二甲 基一氯硅烷，辛基三氯硅烷或者辛基二甲基一氯硅烷，1H，1H，2H，2H-全氟十二烷基三氯硅 烷，1!1，1!1，2!1，2!1-全氟癸基三乙氧基硅烷。
[0022] 3.老化
[0023]將熏蒸完畢的微通道板拿出來，從藍膜上逐個剝離重新放在小玻璃瓶中。在加熱 裝置上以溫度120°C加熱5min。老化之后放入超純水中超聲清洗三分鐘后干燥即可供使用。 [0024] 4.質(zhì)量檢測
[0025] 粗略檢查：用移液器在老化好的微通道板上面滴加0.5yLMi 11 iQ后觀察水滴的形 貌，接觸角大于90度即可。
[0026]拍照測量:將上述形成的液滴用攝像機拍下來，在圖片中測量其接觸角。在拍攝過 程中，要保證水滴的下表面在鏡頭中是俯視看到的，視線與液滴所在平面的夾角在0°以上 5°以下。一般情況下接觸角大于100度說明修飾成功。圖2為微孔板質(zhì)量檢測圖，左圖接觸角 大于100度，修飾成功，右圖不成功。
[0027]制備完成的微通道板如圖3所示，圖3為微通道板微孔板顯微圖片，左圖為放大10 倍，右圖為放大40倍。
[0028]本發(fā)明的另一方面在于提供一種利用微通道陣列板產(chǎn)生液滴的裝置，包括配合的 微通道陣列板和收集裝置，以及加速度產(chǎn)生裝置，微通道陣列板中包含第一液體，收集裝置 中包含第二液體。
[0029]利用慣性力產(chǎn)生液滴的原理如下：在離心作用下，第一液體經(jīng)過具有疏水表面的 微通道，在微通道的末端斷裂成一個個的小液滴，在空氣中飛行很短距離后進入位于收集 裝置內(nèi)的第二液體，形成乳化液滴。在微通道陣列板上方有用于乳液化的水相第一液體的 液滴，而下方是空氣，再下方則是含有表面活性劑的油相第二液體。在高速離心作用下，第 一液體在微通道的下端不斷的生成大小均一的液滴，這些液滴在空氣中飛行很短距離(通 常不超過lcm)，期間由于表面張力形成類似球體的水珠，進而進入第二液體。由于第二液體 中表面活性劑的存在，液滴可以在乳化液中長期穩(wěn)定存在。表面活性劑溶于油而幾乎不溶 于水，但是有具有親水的基團，使得表面活性劑在水油兩相的界面形成一個單分子自組裝 膜，這個膜有效的維持了液滴的穩(wěn)定性同時將水相中與外界分隔開來。讓液滴保持球形形 貌的原因還在于油給液滴提供了其重力80%左右的浮力支持。
[0030] 液滴的大小可以通過調(diào)節(jié)微通道長度、半徑，離心轉(zhuǎn)速/離心加速度，第一液體粘 度，第一液體表面張力來調(diào)節(jié)。生成液滴的速度一方面由離心轉(zhuǎn)速的影響，一方面，當離心 轉(zhuǎn)速不變時，可以通過改變微通道板上通道的數(shù)目來改變生成液滴的速度。利用慣性力產(chǎn) 生液滴的數(shù)學模型如下：
[0031] 參數(shù)符號
[0032] 微通道陣列板上有幾何形狀相同的微通道N個，與液體接觸的面積為A
[0033] 微通道
[0034]橫截面是半徑為R(m)的圓，
[0035] 其面積a，
[0036] 縱向長為l(m)，
[0037] 對流經(jīng)的液體流阻為Z(Pa · s/nf 3)，
[0038] 單位時間第一液體流過體積Q(nf 3/s)，
[0039] 時間為t，開始離心時t = 0;
[0040] 流經(jīng)的液體
[0041 ]表面張力 γ (N*m)，
[0042] 密度 p(kg/m~3)，
[0043] 第一液體粘度η，
[0044] 在微通道陣列板的上方液體高度為h(m)，當t = 0時，h = ho，
[0045] 總體積為 U(nf3)，
[0046] 在液滴化裝置出口的壓力p(Pa);
[0047] 液滴
[0048] 半徑為r，
[0049] 直徑為d，
[0050] 體積 V，
[0051] 質(zhì)量 m;
[0052] 其他：
[0053] 自然對數(shù)的底數(shù)e
[0054] 數(shù)學方程
[0055] 液滴質(zhì)量計算公式:假設(shè)重力與表面張力相等并且液滴拉斷處與微通道的半徑一 致為R，有· γ · R=G · m
[0056] 液滴質(zhì)量一體積一半徑計算公式
[0057] 在外加加速度為G時，液滴體積
[0058] 半徑計算公式
[0059] 據(jù)此，我們調(diào)整離心轉(zhuǎn)速或者改變微通道的半徑R以改變生成的液滴的大小。
[0060] 假設(shè)液體在眾多微通道中流動遵循公式
[0061 ] 流量
[0062] 其中壓強p = pGh
[0063] 流阻，
[0064] 進而單個微通道的流量可以表示為
[0065] 據(jù)此，液面高度公式可以通過微積分得到，為：
[0066] 對于孔徑為6μπι的微孔板，通過不同大小的離心力作用，可以得到不同的大小的微 乳液滴，
[0068]預(yù)測值與實際值的差異可能是由于液體流動使得模型偏離靜態(tài)假設(shè)導致。
[0069]當h接近于0時，認為液滴基本走完，我們?nèi) = 0.01 X ho，此時99 %的液體流過了 微通道陣列板。實際操作中發(fā)現(xiàn)液滴的殘余量極少，少于千分之一分析天平的檢測限，即 0.001g〇
[0070]優(yōu)選的，第一液體為水相液體，為用于生物反應(yīng)的樣品（可以是用于數(shù)字鏈式酶反 應(yīng)的混合液，細胞懸浮液，細菌懸浮液，用于基因組擴增的DNA溶液，用于RNA逆轉(zhuǎn)錄的混合 液，用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的混合液，用于無機鹽結(jié)晶的混合液，病原物溶液或懸濁液等），第二液 體為含有表面活性劑的油相液體。
[0071 ]第二液體中的油相可以是礦物油(如低沸礦物油，輕礦物油），硅油(如低聚二甲基 硅氧烷，環(huán)戊硅氧烷，脂肪基硅氧烷，苯基硅氧烷，氣代硅氧烷），脂肪酸甘油酯(雙月桂酸甘 油酯，油酸甘油酯，亞油酸甘油酯，硬脂酸甘油酯，亞麻酸甘油酯，異硬脂酸甘油酯，山梨酸 甘油酯），碳酸雙酯(如碳酸雙4-甲基-辛酯，碳酸雙十六酯，碳酸雙山梨醇酯，碳酸雙2-乙基 己酯，碳酸雙2-乙基辛酯，碳酸雙2-乙基癸酯，碳酸雙4-甲基-壬酯，碳酸雙3-甲基-癸酯，碳 酸雙正辛酯），月桂酸異丙酯，月桂酸己酯，月桂酸庚酯，月桂酸辛酯，馬來酸己酯，馬來酸辛 酯，棕櫚酸異丙酯，棕櫚酸丁酯，棕櫚酸己酯，棕櫚酸叔丁酯，山梨酸月桂醇酯，食用菜籽油， 葵花籽油，蓖麻油，花生油，茶籽油中一種或幾種的混合物。
[0072] 第二液體中的表面活性劑可以是十六烷基磺酸鈉，Tween?20，Tween?21，Tween? 40，Tween? 60，Tween?61，T'veen?65，Tween?:80，sPan?20，sP an? 40，Span? 60，s.pan?80，sPan?. 83，Span?.85，Span? 120，Abil.?we09，AM?em90，Abili)eml20，AM?eml80，DowG〇rning? 5200， D〇wC〇ming?ES-5300,D〇wG〇EMng? emulsifier 10, Dehymuls? SML, Cremophor?f 〇 7 ; Isokn? GI 34,Is〇kn?GI PDlTegmof^Alkanol S 2 Pellets其中一種或者多種混合?！?br>[0073] 優(yōu)選的，第二液體中的油相為碳氫基油，其具有比水略小的密度，可以讓水相液滴 進入后沉到油相底面而不會留在油表面與接下來產(chǎn)生的液滴發(fā)生碰撞。油的較低粘度保障 了液滴在進入油時不會被撞擊力打碎。特定配方的油可以在10攝氏度左右發(fā)生固化，進而 將乳液凍住，這樣液滴可以長期保存在10攝氏度的環(huán)境中而保持良好的形態(tài)和分隔特性。 [0074]收集裝置可以為離心管，八聯(lián)排離心管或96孔板。一般采用的離心管為Eppendorf 公司的1.5mL離心管或Qiagen公司的200μ1 PCR管，后者的使用需要通過轉(zhuǎn)換支架與 Eppendorf 1.5ml離心管配合。使用1.5ml離心管時，須保證液滴飛行距離不超過8mm，一般 控制在5mm內(nèi)為宜，需加入第二液體700到1200μ1，優(yōu)選1000μ1。使用200μ1 PCR管時，一般加 入150到250μ1第二液體，優(yōu)選240μ1。
[0075] 微通道陣列板也可以通過夾具與收集裝置配合，放置于加速度產(chǎn)生裝置上。夾具 使微通道陣列板在離心時得到固定，同時起到密封的作用，確保微通道板中的液體不會從 微通道板的微通道朝向收集裝置的一端以外的位置流出，即確保第一液體只從微通道中流 出。
[0076] 與離心管配合的夾具包括螺栓和連接部件。微通道陣列板被夾緊在螺栓和連接部 件之間，連接部件下端連接離心管。
[0077] 其中螺栓包括公螺紋，連接部件包括母螺紋，公螺紋為螺栓的外螺紋，母螺紋為連 接部件的內(nèi)螺紋，公螺紋和母螺紋相互配合。螺栓內(nèi)部為一通孔，從該通孔處向微通道陣列 板中加入第一液體。連接部件包括自上端面形成的盲孔，盲孔在連接部件中形成內(nèi)端面，使 用時，微通道陣列板位于內(nèi)端面之上。盲孔內(nèi)壁有內(nèi)螺紋即母螺紋，盲孔直徑與微通道陣列 板的外徑相適應(yīng)。內(nèi)端面到下端面形成通孔，微通道陣列板產(chǎn)生的液滴由該通孔進入收集 裝置。該通孔為從上到下直徑逐漸增大的圓錐孔，該圓錐孔最小直徑小于內(nèi)端面的內(nèi)徑。連 接部件下端面外徑與收集裝置內(nèi)徑相適應(yīng)。使用時，微通道板夾緊于螺栓的下端面與連接 部件的內(nèi)端面之間。
[0078] 連接部件的高度為8~15mm，優(yōu)選11mm。上端面外徑10~13mm，優(yōu)選12mm;內(nèi)端面內(nèi) 徑7~10mm，優(yōu)選8.8mm。連接部件還具有一連接部件頭，其外側(cè)面做成乳花或者表面粗糙磨 砂效果，以增加表面摩擦。盲孔深9_，至少8_，內(nèi)螺紋規(guī)格可以是英制1/4-28，國標M4或者 國標M5。從內(nèi)端面繼續(xù)往下打圓錐形通孔，直徑從上到下直徑逐漸放大，通孔直徑最小處 3mm，圓錐頂角至少50度，優(yōu)選60度。
[0079 ] 螺栓高度為12~18mm，優(yōu)選14 · 5mm。螺栓頭外徑8~13mm，以10mm為宜。螺栓頭高度 約6.5mm螺栓頭外側(cè)面做成乳花或者表面粗糙磨砂效果，以增加表面摩擦。螺栓的桿部有與 母螺紋配合的外螺紋即公螺紋，規(guī)格可以是英制1/4-28,國標M4或者國標M5。螺栓內(nèi)部為一 通孔，從該通孔處向微通道陣列板中加入第一液體。該通孔由自上而下依次為直徑為7_的 孔，錐形孔，直徑為3mm的孔，直徑7mm的孔高度為3mm，錐形孔連接直徑為7mm和直徑為3mm的 孔。加工時可先從下底面向上，打一個直徑為3mm的通孔;再從上表面向下，打一個直徑為 7_深度為3mm的孔，再從該孔往下打一個直徑向下逐漸變小直到與3_的通孔相切的錐面， 錐面(單邊)角度30度到50度，45度為宜。
[0080] 螺栓和連接部件的材質(zhì)可以為PEEK。
[0081] 微通道板和連接部件的內(nèi)端面之間還有一密封墊片，為外徑5mm左右，內(nèi)徑3mm左 右的圓環(huán)。厚度〇 . 2到2mm，以1mm為宜?？捎刹粨讲ＡЮw維的PEEK(聚醚醚酮)塑料通過機械 精加工得到，也可以用軟板切割得到。其中聚四氟乙烯(Teflon)切割而成的墊片效果最好。 墊片的材料還可以為橡膠。
[0082] 裝配微通道板和夾具時，先用鑷子將微通道板平放在連接部件的內(nèi)端面，再平放 入一個墊片，后將螺栓擰緊即可。將固定好的微通道板與夾具的配合物稱為夾持微通道板。 如果擰緊后又擰松并將墊片拿出，要換一個新的墊片以免密封性不佳。
[0083] 收集裝置可以為熱塑性材料，優(yōu)選ABS、PP、POM、PC、PS、PVC、PA、PMMA等熱塑性塑料 或者TPV等熱塑性橡膠，通過加熱使微通道板與收集裝置密封。
[0084]加速度產(chǎn)生裝置為離心機，采用的離心機配有吊籃式離心管架，可提供至少 160000米每平方秒的離心加速度。
[0085]本發(fā)明的第三方面在于提供一種利用微通道陣列板并行產(chǎn)生液滴的裝置產(chǎn)生液 滴的方法，其特征在于，包含如下步驟:使微通道微通道板與收集裝置配合，放置于加速度 產(chǎn)生裝置上，在液滴化裝置中加入第一液體、收集裝置中加入第二液體，設(shè)置加速度產(chǎn)生裝 置的轉(zhuǎn)速，產(chǎn)生液滴。
[0086]本發(fā)明的有益效果是，
[0087] 1)產(chǎn)生液滴均勻。微通道陣列板的生產(chǎn)可以做到各個孔道的半徑差異很小，其相 對標準差可以控制在3%以內(nèi)，且生產(chǎn)重復(fù)性高，前后批次小，從而能夠在多通道多批次生 成均勻的微乳液滴。
[0088] 2)可調(diào)性。微通道微通道板的微通道微通道可以任意設(shè)計不同直徑。通過離心力 可微調(diào)液滴產(chǎn)生的大小。相比與微流芯片產(chǎn)生液滴時不明確的調(diào)整規(guī)律(通過調(diào)整兩相氣 壓或流速調(diào)整液滴大?。?，微通道微通道板上使用離心法產(chǎn)生液滴時，對液滴大小的調(diào)整具 有明確簡單的數(shù)學規(guī)律。
[0089] 3)穩(wěn)定性。一旦確定所用微通道板的孔徑和離心力，液滴大小將不會再變化?？山?受有微量固體雜質(zhì)的樣品如未過濾的生物樣本處理液，如果出現(xiàn)堵塞情況，可以在簡單清 洗后繼續(xù)使用。而微流控產(chǎn)生液滴的方法中，管路流阻，液體流阻，微擾等都會影響液滴直 徑，且只有一個液滴發(fā)生噴口，一旦堵塞則實驗失敗。毛細管由于其制備工藝造成端口容易 堵塞。
[0090] 4)可批量生產(chǎn)，結(jié)構(gòu)簡單，造價低。微通道板可由光纖拉制，批量磨刨，腐蝕，修飾； 通道量的增加并不增加加工難度，可得到大量一致性的微通道陣列板，可一次性使用;PEEK 夾具則可由注塑生產(chǎn)，成本低。相比之下，微流芯片需要MEMS工藝生產(chǎn)，鍵合，封裝，工藝復(fù) 雜成本高。而目前的毛細管要形成如此細小的端口，只能用硼玻璃在高溫下拉出一個細端， 再剪斷，此工藝重現(xiàn)性差，產(chǎn)量低，且隨通道數(shù)量增加加工難度大大增加。同時，微通道板的 機械性能更強，便于包裝;而毛細管微通道容易彎折破碎，操作復(fù)雜。
[0091] 5)可控溫。使用低溫離心機則可(例如eppendorf 5430R);傳統(tǒng)微流芯片方法若想 要降溫則需要把樣品倉，管路，芯片和部分驅(qū)動裝置都實現(xiàn)降溫，操作復(fù)雜。
[0092] 6)節(jié)約樣品。微通道道陣列版的孔道體積極小，可能造成的樣品殘留極少，而微流 芯片的進樣管路中不可避免的存在無法消耗的樣品，毛細管玻璃只在端口收細，長度是微 通道道陣列版的幾倍，造成了樣品浪費。
[0093] 7)高通量。微通道陣列板能夠允許超過100甚至1000孔的設(shè)計，可以大大的提高液 滴生成速度和通量，同時允許更加微縮的設(shè)計;還可以利用電子顯微鏡簡單快捷大量的進 行質(zhì)量檢測。
[0094] 8)相比于微流控的辦法和單孔針離心的辦法，該發(fā)明可以將生物樣品完全液滴 化，不存在死體積，可以更大程度的利用生物樣品，得到更多信息，反應(yīng)更加全面真實的情 況。
【附圖說明】
[0095] 以下結(jié)合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0096]圖1為微通道板的生產(chǎn)流程圖。
[0097]圖2為微通道板質(zhì)量檢測圖，左圖接觸角大于100度，修飾成功，右圖不成功。
[0098]圖3為微通道板顯微圖片，左圖為放大10倍，右圖為放大40倍。
[0099]圖4為螺栓、連接部件、墊片、微通道板與1.5ml離心管的裝配圖。
[0100]圖5為螺栓、連接部件、墊片、微通道板與200ul離心管的裝配圖。
[0101] 圖6為利用微孔板產(chǎn)生A樣品的液滴后進行30輪PCR之后的明場照片和熒光照片。
[0102] 圖7為利用微孔板產(chǎn)生B樣品的液滴后進行30輪PCR之后的明場照片和熒光照片。
【具體實施方式】
[0103] 實施例1微通道板與收集裝置的配合
[0104] 微通道板與1.5mL離心管配合
[0105] 將lml第二液體加入離心管中，由于第二液體極易產(chǎn)生氣泡，務(wù)必要緩慢加入，形 成氣泡后，可以用lml移液器換上新槍頭后，快速對準氣泡打出氣體，氣泡即被吹破。
[0106] 裝配圖如圖4所示。1螺栓，1.1螺栓頭，1.2螺栓下端面，1.3公螺紋，1.4通孔，2墊 片，3微通道陣列板，4連接部件，4.1連接部件頭，4.2連接部件下端面，4.3母螺紋，4.4內(nèi)端 面，5 1.5mL離心管(此處將蓋子省略）。兩個螺紋旋緊后固定微通道板，輕放在裝有第二液 體的離心管中即可。
[0107] 微通道板與200μ1離心管配合
[0108] 裝配圖如圖5所示。螺栓、墊片、微通道陣列板和連接部件的位置關(guān)系同圖4,6為 200μ1離心管，7為轉(zhuǎn)換支架，8為1.5mL離心管。使用時，先將微通道板與墊圈一次平放入連 接部件中，用螺栓擰緊得到一個微通道管，后在200μ1離心管中加入200μ1第二液體，剪去 200μ1離心管的蓋子，用鑷子夾住200μ1離心管的上邊后放入放有轉(zhuǎn)換支架的1.5ml離心管 中，最后將微通道管放在1.5ml離心管中，讓后者的管沿托住微通道管即可。轉(zhuǎn)換支架是3D 打印得到的。
[0109] 裝配好后，產(chǎn)生液滴時用移液器從螺栓的通孔中向微通道板中加入20~100μΙ水 相樣品液。高速離心機中離心數(shù)分鐘即可。其中離心機配備吊籃式轉(zhuǎn)子，保證離心管的方向 與離心力重力合力方向一致，才能讓液滴落到離心管底部而不是黏附在管壁上。
[0110] 實施例2
[0111] 將本發(fā)明的裝置產(chǎn)生的液滴用于基于TaqMan探針的數(shù)字鏈式酶反應(yīng)(dPCR)檢測 微量DNA樣品
[0112] 該實施例中第二液體配方是月桂酸異丙酯/Abilem 180v/v 83/17溶液，收集裝置 是1.5ml離心管。
[0113] 第一液體的配制方法
[0114] 先配制如下混合液（1)，其中引物是根據(jù)lambda phage DNA中一段長223bp的序列 設(shè)計的引物，用于PCR擴增，同時TaqMan探針也是基于此段序列設(shè)計的。
[0116]得到混合液（1)后，取混合液99μ1加入lylDNA模板。此DNA模板是經(jīng)過瓊脂糖凝膠 純化后的產(chǎn)物，其濃度由Nanodrop確定。分別將ΙμL 1.00*10~6拷貝和ΙμL 1.00*10~5加入 99μ1混合液(1)中得到反應(yīng)樣液Α和Β。其中
[0118] 分別取上述A，B各20μ1于螺栓的通孔處加入兩個夾持微通道板上，離心13000rCf， 4min后得到均勻微乳液滴。經(jīng)過30輪PCR之后，將上述液滴平攤在疏水培養(yǎng)皿中在熒光顯微 鏡下觀察，分別如圖6和圖7所不。
[0119] A樣品：同一視野下，圖6左圖為明場照片，右圖是熒光照片（其中液滴大小直徑平 均50微米，體積CV18% )，理論上每個液滴含有0.66個DNA分子，將有48.1 %的液滴有熒光。 實際測量值為49.0+/-0.5 %。
[0120] B樣品：同一視野下，圖7左圖為明場照片，右圖是熒光照片（其中液滴大小直徑平 均65微米，體積CV23 % )，理論上每個液滴含有0.14個DNA分子，將有13 %的液滴有熒光。實 際測量值為15+/-0.9%。
【主權(quán)項】
1. 一種微通道陣列板的制備方法，其特征在于，包括W下步驟：（1)取兩種不同的光纖 玻璃棒，其中一種不能被腐蝕液腐蝕，一種能夠被腐蝕液腐蝕，將二者緊密排列，在高溫下 融化為一個整體，經(jīng)過一次或多次拉制為長而細的玻璃棒，將拉細的玻璃棒切割為小片，得 到微通道板毛巧；（2)對毛胚進行腐蝕除去忍料，得到帶通孔的微通道板；（3)對微通道板進 行疏水處理。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的微通道陣列板的制備方法，其特征在于，腐蝕液為硝酸和燒堿，硝 酸的濃度不超過Imol/L，優(yōu)選0.3~0.5mol/L，燒堿不超過2mol/L，優(yōu)選0.5mol/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的微通道陣列板的制備方法，其特征在于，對毛胚進行腐蝕除去忍料 時，將腐蝕過程中的玻璃板從硝酸液中取出，洗凈之后在燒堿溶液中超聲浸泡一定時間，再 在酸液中繼續(xù)腐蝕，交替往復(fù)進行;腐蝕液中可W滲入少量氣離子。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的微通道陣列板的制備方法，對微通道板進行疏水處理所用的試劑 為氣基的疏水試劑。所述氣基的疏水試劑優(yōu)選氣代燒控，更優(yōu)選氣代硅烷。所述氣代硅烷為 Ξ甲基氯硅烷，Ξ全氣甲基氯硅烷，Ξ甲氧基丙基硅烷，Ξ甲氧基1H，1H，2H，2H-全氣辛基娃 燒，丙基Ξ氯硅烷，1H，1H，2H，2H-全氣辛基Ξ氯硅烷，（2，4-二氣苯基乙烘基)Ξ甲基硅烷， (3,5-二氣苯基乙烘基)Ξ甲基硅烷，（3,5-雙(Ξ氣甲基）苯乙烘基)Ξ甲基硅烷，Ξ乙基(Ξ 氣甲基）硅烷，Ξ乙氧基[4-(Ξ氣甲基）苯基]硅烷，氯二甲基（五氣苯基)硅烷，1H，1H，2H， 2H-全氣辛基Ξ氯硅烷，1H，1H，2H，2H-全氣辛基二甲基一氯硅烷，辛基Ξ氯硅烷或者辛基二 甲基一氯硅烷，1H，1H，2H，2H-全氣十二烷基Ξ氯硅烷，1H，1H，2H，2H-全氣癸基Ξ乙氧基娃 燒中的一種或幾種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1的微通道陣列板的制備方法，所述對微通道板進行疏水處理，是采用 化學氣相沉積法、浸泡和溶劑揮發(fā)等方法對玻璃表面進行修飾，優(yōu)選化學氣相沉積法。6. 根據(jù)權(quán)利要求1的微通道陣列板的制備方法，進行疏水處理后微通道板的接觸角大 于90度。7. -種利用權(quán)利要求1-6任一項的微通道陣列板產(chǎn)生液滴的裝置，包括配合的微通道 陣列板和收集裝置，W及加速度產(chǎn)生裝置，微通道陣列板中包含第一液體，收集裝置中包含 第二液體，第二液體包含油相和表面活性劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其中，第一液體為水相液體，為用于生物反應(yīng)的樣品，例 如用于數(shù)字鏈式酶反應(yīng)的混合液，細胞懸浮液，細菌懸浮液，用于基因組擴增的DNA溶液，用 于RNA逆轉(zhuǎn)錄的混合液，用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的混合液，用于無機鹽結(jié)晶的混合液，病原物溶液 或懸濁液，用于聚合反應(yīng)的混合液，用于凝膠化反應(yīng)的混合液等，第二液體為含有表面活性 的油相液體。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其中，第二液體中的油相可W是礦物油(如低沸礦物油， 輕礦物油等），硅油（如低聚二甲基硅氧烷，環(huán)戊硅氧烷，脂肪基硅氧烷，，苯基硅氧烷，氣代 硅氧烷等），脂肪酸甘油醋(雙月桂酸甘油醋，油酸甘油醋，亞油酸甘油醋，硬脂酸甘油醋，亞 麻酸甘油醋，異硬脂酸甘油醋，山梨酸甘油醋等），碳酸雙醋(如碳酸雙4-甲基-辛醋，碳酸雙 十六醋，碳酸雙山梨醇醋，碳酸雙2-乙基己醋，碳酸雙2-乙基辛醋，碳酸雙2-乙基癸醋，碳酸 雙4-甲基-壬醋，碳酸雙3-甲基-癸醋，碳酸雙正辛醋等），月桂酸異丙醋，月桂酸己醋，月桂 酸庚醋，月桂酸辛醋，馬來酸己醋，馬來酸辛醋，棟桐酸異丙醋，棟桐酸下醋，棟桐酸己醋，棟 桐酸叔下醋，山梨酸月桂醇醋，食用菜巧油，葵花巧油，藍麻油，花生油，茶巧油中一種或幾 種的混合物。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其中，第二液體中的表面活性劑可W是十六烷基橫酸 鋼，'1'詔'660@2〇,了曲'明11霞21,7'\^畑電'4〇,了化66打愈'6〇,了巧€611@61,了'\^6凸麼65,了^￥6邸麼8〇,§腳11飯2〇, 卻抑感 40，Span? 60，Span蟹 80，Span? 8 3，卻化感 8 5，Span? 12 0，Abi峨 We 0 9，Abi晚 em9 0，A時峻 eml20, Abi!? eml80 ,Dow Coming? 5200 ,DowComing?ES-5300 ,DowCommg? emulsifier 10, Dehyrauls?SML,打em〇phor?.W0 7，Isolan必GI 34 , Isokn麼GI PDI，Tegosoft?Alkanol S 2 Pellets其中一種或者多種混合。11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其中，第二液體中的油相為碳氨基油，其具有比水略小 的密度，可W讓水相液滴進入后沉到油相底面而不會留在油表面與接下來產(chǎn)生的液滴發(fā)生 碰撞。12. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其中，第二液體中的油相優(yōu)選能夠在-10-20°C氏度左 右發(fā)生固化。13. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其中，收集裝置可W為熱塑性材料，優(yōu)選ABS、PP、P0M、 口(：、口5、？￥(：、？4、?114等熱塑性塑料或者了?￥等熱塑性橡膠，通過加熱使微通道板與收集裝置 密封。14. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其中，收集裝置為離屯、管。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，其中，微通道陣列板通過夾具與收集裝置配合，放置 于加速度產(chǎn)生裝置上。夾具包括螺栓和連接部件。微通道陣列板被夾緊在螺栓和連接部件 之間，連接部件下端連接罔心官。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的裝置，其中，螺栓包括公螺紋，連接部件包括母螺紋，公螺紋 為螺栓的外螺紋，母螺紋為連接部件的內(nèi)螺紋，公螺紋和母螺紋相互配合。螺栓內(nèi)部為一通 孔，從該通孔處向微通道陣列板中加入第一液體。連接部件包括自上端面形成的盲孔，盲孔 在連接部件中形成內(nèi)端面，使用時，微通道陣列板位于內(nèi)端面之上，內(nèi)端面到下端面形成通 孔，微通道陣列板產(chǎn)生的液滴由該通孔進入收集裝置，連接部件下端面外徑與收集裝置內(nèi) 徑相適應(yīng)。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的裝置，連接部件包括自上端面形成的盲孔，盲孔在連接部件 中形成內(nèi)端面，盲孔內(nèi)壁有內(nèi)螺紋即母螺紋，盲孔直徑與微通道陣列板的外徑相適應(yīng)。內(nèi)端 面到下端面形成通孔，該通孔為從上到下直徑逐漸增大的圓錐孔，該圓錐孔最小直徑小于 內(nèi)端面的內(nèi)徑。使用時，微通道板位于螺栓的下端面與連接部件的內(nèi)端面之間。18. 根據(jù)權(quán)利要求16-17之一所述的裝置，螺栓內(nèi)部為一通孔，該通孔由自上而下依次 為大直徑為圓孔，錐形孔，小直徑圓孔，錐形孔連接大直徑圓孔和小直徑圓孔。錐孔角度30 度到50度，45度為宜。19. 根據(jù)權(quán)利要求16-18之一所述的裝置，收集裝置還可W包括轉(zhuǎn)換支架，通過轉(zhuǎn)換支 架與其他規(guī)格的離屯、管配合。20. -種利用權(quán)利要求7-19任一項所述的裝置產(chǎn)生液滴的方法，其特征在于，包含如下 步驟:使微通道微通道板與收集裝置配合，放置于加速度產(chǎn)生裝置上，向微通道微通道板與 收集裝置的配合物中加入第一液體、收集裝置中加入第二液體，設(shè)置加速度產(chǎn)生裝置的轉(zhuǎn) 速，產(chǎn)生液滴。
【文檔編號】B01L3/00GK106076443SQ201610409019
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】黃巖誼, 陳子天, 廖珮宇, 張芳麗
【申請人】北京大學