專利名稱：一種基于銪配合物的一氧化氮熒光探針及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一氧化氮的熒光測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種可用于水溶液及生物 體系中一氧化氮熒光測(cè)定的銪配合物熒光探針及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在生物體系中，一氧化氮(NO)能通過生物體自動(dòng)合成并能在動(dòng)物、植物、真 菌、細(xì)菌體內(nèi)與其他一些自由基分子或金屬蛋白快速反應(yīng)，從而發(fā)揮重要的生理、病理 作用。在生物體內(nèi)，低濃度的NO作為細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間一種信號(hào)傳導(dǎo)分子在血液循環(huán)、 免疫、神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用(文獻(xiàn)1 :R. Μ. J. Palmer, A. G. Ferrige，S. Moncada， Naturel987，327，524 ；文獻(xiàn) 2 :S. H. Snyder，Sciencel992，257，494 ；文獻(xiàn) 3 :V. Holan, M. Krulova, A. Zajicova, J. Pindjakova, Mol. Immunol. 2002, 38,989 ；文獻(xiàn) 4 :S. Jasid, Μ. Simontacchi, C. G. Bartoli, S. Puntarulo, Plant Physiol. 2006，142，1246)，而當(dāng) NO 的 濃度過高時(shí)，便與體內(nèi)其他活性氧物種(ROS)反應(yīng)產(chǎn)生大量的活性氮物種(RNS)(文獻(xiàn)5 F. L. M. Ricciardolo, P. J. Sterk, B. Gaston, G. Folkerts, Physiol. Rev. 2004，84，731)，進(jìn)而 對(duì)核酸、脂肪以及蛋白質(zhì)等生物分子造成損害。由于NO具有非常重要的生理作用，建立靈敏的NO檢測(cè)方法，特別是生物體系中的 NO檢測(cè)方法越來越引起人們的關(guān)注。目前，NO檢測(cè)主要有以下幾種方法(1)利用NO是一種自由基特征的磁共振波譜法(文獻(xiàn)6 :T. Yoshimura, H. Yokoyama, S. Fujii, F. Takayama, K. Oikawa, H. Kamada, Nat. Biotechnol. 1996,14,992 ；文 獻(xiàn) 7 :Y. Katayama, N. Soh, Μ. Maeda, Chem. Phys. Chem. 2001，2，655)，但是，由于 NO 在液相中 半衰期極短，極容易被氧化成其它氮氧化物，使得該方法靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和應(yīng)用范 圍上略有不足。(2)分光光度法，利用NO易被氧化成N02_，進(jìn)而在酸性條件下與Griess試劑反 應(yīng)生成重氮化物的方法(文獻(xiàn) 8 :L. C. Green，D. A. Wagner, J. Glogowski, P. L. Skipper, J. S. ffishnok, S. R. Tannenbaum, Anal. Biochem. 1982，126，131)，該方法操作簡單，但準(zhǔn)確
度、靈敏度較低。(3)電化學(xué)法，利用NO容易被氧化而發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，從而對(duì)NO濃度進(jìn)行測(cè) 定的方法(文獻(xiàn) 9 :T. Malinski, Ζ. Taha, Naturel992, 358,676 ；文獻(xiàn) 10 :F. Bedioui, N. Villeneuve, Electroanal. 2003，15，15)，該方法靈敏度高、電極穩(wěn)定性好、使用壽命長， 但可用于細(xì)胞內(nèi)NO測(cè)定的電極制作困難，且將這種電極插入細(xì)胞會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大的損 傷。(4)化學(xué)發(fā)光法，用氧化劑將NO氧化成二氧化氮后利用激發(fā)態(tài)二氧化氮返回基態(tài) 時(shí)釋放能量而發(fā)光的方法(文獻(xiàn) 11 J. F. Brien, B. E. McLaughlin, K. Nakatsu, G. S. Marks, Methods Enzymo 1. 1996，268，83)，該方法靈敏度高，但是操作復(fù)雜，而且在操作過程中使用 的氧化劑如臭氧、過氧化氫等對(duì)細(xì)胞的損害很大，很難用于細(xì)胞體系中NO的測(cè)定。(5)使用熒光探針的測(cè)定法(文獻(xiàn) 12 :H. Kojima，N. Nakatsubo, K. Kikuchi,S. Kawahara, Y. Kirino, H. Nagoshi, Y. Hirata, T. Nagano, Anal. Chem. 1998,70, 2446 ；文 獻(xiàn) 13 :M. H. Lim, D. Xu, S. J. Lippard, Nat. Chem. Biol. 2006，2，375 ；文獻(xiàn) 14 :Ε· W. Miller, C. J. Chang, Curr. Opin. Chem. Biol. 2007,11,620)，該方法具有操作簡單、靈敏度高、選擇 性好等特點(diǎn)，是目前最為理想的檢測(cè)方法之一。但目前已有的NO熒光探針?biāo)褂玫臒晒?團(tuán)都是有機(jī)熒光分子，這些有機(jī)熒光團(tuán)存在光穩(wěn)定性差、易被光漂白、Stokes位移較小，在 用于復(fù)雜生物體系測(cè)定時(shí)易受到體系共存雜質(zhì)背景熒光干擾等缺點(diǎn)(文獻(xiàn)15 :Z. Zhang, S. Achilefu, Org. Lett. 2004，6，2067)。另外，雖然這些熒光探針分子能夠穿過細(xì)胞膜與細(xì) 胞內(nèi)的NO反應(yīng)而產(chǎn)生熒光信號(hào)，但這些探針分子與NO的反應(yīng)產(chǎn)物也很容易從細(xì)胞中溢出 (文獻(xiàn) 16 :L. Ε. McQuade, S. J. Lippard, Curr. Opin. Chem. Biol. 2009，14，1)，從而在熒光測(cè) 定時(shí)產(chǎn)生誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種靈敏度高、選擇性及水溶性好、適用范圍廣、 可用于水溶液及生物體系中NO熒光測(cè)定的銪配合物熒光探針及應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下以三價(jià)銪離子與有機(jī)配位體4，- [4- (3，4- 二氨基苯氧基)苯基]-2，2，6，，2 ”_聯(lián) 三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸形成的配合物(簡稱DATTA-Eu3+)為一氧化氮熒光探針，其中 所述有機(jī)配位體DATTA結(jié)構(gòu)式為 與細(xì)胞共培養(yǎng)可進(jìn)入細(xì)胞的三價(jià)銪離子與有機(jī)配位體4’ -[4-(3，4_ 二氨基苯氧 基)苯基]_2，2’:6’，2”-聯(lián)三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸的乙酸亞甲基酯形成的配合物為
一氧化氮熒光探針，其中所述有機(jī)配位體結(jié)構(gòu)式為 所述基于上述銪配合物的NO熒光探針的應(yīng)用過程為在各類生物及非生物環(huán)境 中，利用所述的銪配合物熒光探針-Eu3+與體系中NO反應(yīng)生成DATTA的苯并三唑衍生物 4，-[4-(苯并三唑-6-氧)苯基]_2，2，:6，，2”-聯(lián)三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸與Eu3+的 配合物(簡稱ΒΡΤΤΑ-Eu3+)，導(dǎo)致探針在612nm波長處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，然后通過熒光 測(cè)定法確定NO的產(chǎn)生及生成量。所述熒光測(cè)定法除了常規(guī)的熒光測(cè)定法外，還包括時(shí)間分 辨熒光測(cè)定法、熒光顯微鏡成像測(cè)定法及時(shí)間分辨熒光顯微鏡成像測(cè)定法。所述NO測(cè)定用銪配合物熒光探針可用于含有其組份的測(cè)定試劑盒及相關(guān)試劑 中。本發(fā)明的熒光探針具有如下優(yōu)點(diǎn)1.具有很好的水溶性，適用于水溶液中各種化學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞及生物組織等體 系中NO的測(cè)定。2.熒光壽命長，可用于百微秒級(jí)的時(shí)間分辨熒光測(cè)定，以消除背景熒光對(duì)測(cè)定的 干擾。3.穩(wěn)定性高，能長期保存使用。4.具有較高的NO測(cè)定靈敏度，最低檢測(cè)下限為8. 4nmol/L。5.對(duì)NO有很好的選擇性，與其他的活性氧物種作用時(shí)熒光信號(hào)幾乎無變化。6.在生理pH值的水溶液中可迅速與NO反應(yīng)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，其熒光量子效率 增大47倍。7.經(jīng)溴甲基乙酸酯酯化后在普通培養(yǎng)條件下即可進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)，特異性地與細(xì)胞 內(nèi)的一氧化氮反應(yīng)，引起探針的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，進(jìn)而用于活細(xì)胞中NO的熒光測(cè)定。


圖1是有機(jī)配位體DATTA的合成路線圖。圖2是BPTTA-Eu3+與NO的反應(yīng)原理圖及反應(yīng)前后溶液的熒光顏色變化。圖3 是在 pH 值 7. 4 的 0. 05mol/L 硼酸緩沖溶液中 DATTA_Eu3+(2· 0 μ mol/L,實(shí)線) 及其與NO反應(yīng)產(chǎn)物BPTTA-Eu3+(2. 0 μ mol/L，虛線)的熒光光譜圖。圖 4 是 DATTA-Eu3+ (2. 0 μ mol/L)及其與 NO 反應(yīng)產(chǎn)物 BPTTA-Eu3+ (2. 0 μ mol/L)在 不同PH值的0. 05mol/L硼酸緩沖溶液中的熒光強(qiáng)度變化圖。圖 5 是 DATTA-Eu3+ (2. 0 μ mol/L)及其與 NO 反應(yīng)產(chǎn)物 BPTTA-Eu3+ (2. 0 μ mol/L)在不同PH值的0. 05mol/L硼酸緩沖溶液中的熒光壽命變化圖。圖6是DATTA-Eu3+(0. 1 μ mol/L)在pH值7· 4的0. 05mol/L硼酸緩沖溶液中與各 種活性氧物種(10 μ mol/L)反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度比較圖。圖7 是 DATTA-Eu3+(1. 0 μ mol/L)與不同濃度 NO 在 pH 值 7. 4 的 0. 05mol/L 硼酸緩 沖溶液中反應(yīng)后其產(chǎn)物熒光光譜的變化情況圖。圖8是DATTA-Eu3+在pH值7. 4的0. 05mol/L硼酸緩沖溶液中檢測(cè)NO的工作曲線圖。圖9是DATTA-Eu3+標(biāo)記的桅子細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間下的明場(chǎng)成像、熒光成像及時(shí) 間分辨熒光成像測(cè)定結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合技術(shù)方案和附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例。本實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā) 明進(jìn)行說明，基于相同原理和類似原料的方法也屬本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 有機(jī)配位體DATTA的合成合成路線如圖1所示，基體操作過程如下。(1)4，-(4-甲氧基苯基)_2，2，6，，2”_聯(lián)三吡啶(化合物1)的合成在300mL含有24. 2克(0. 2mol) 2_乙?；拎さ娜芤褐屑尤?0mL的10mol/L氫 氧化鉀，室溫?cái)嚢?0分鐘后加入13. 6克的4-甲氧基苯甲醛(0. Imol)，室溫繼續(xù)攪拌15 分鐘后再加入150mL的濃氨水。反應(yīng)液在50°C下攪拌12小時(shí)，過濾收集沉淀，用水充分洗 滌后再用少量的冷甲醇洗滌。粗產(chǎn)品經(jīng)過乙醇重結(jié)晶后得到17克的化合物1，產(chǎn)率50%。 1HNMr(CDCI3)測(cè)定結(jié)果8. 74(s，2H)，8· 69 (d, J = 8. OHz, 2H) ,7. 92-7. 90 (m, 4H), 7. 37 (t, J =6. 4Hz，2H)，7. 04 (d, J = 8. OHz, 2H) ,3. 89(s，3H)。(2)6，6”_ 二腈基-4，-(4-甲氧基苯基)_2，2，6，，2”_聯(lián)三吡啶(化合物2)的 合成將1. 82克化合物1 (5. 4mmol)溶于IOOmLCH2Cl2后加入3. 70克的間氯過氧化苯甲 酸(m-CPBA，21.4mmol),反應(yīng)液室溫?cái)嚢?4小時(shí)。用IOOmL的10% Na2CO3水溶液洗滌有機(jī) 相2次，再用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，蒸去溶劑。所得固體真空干燥后溶于40mL的CH2Cl2 中，加入3. 73克的三甲基氰基硅(37. 5mmol)，室溫?cái)嚢?0分鐘后，慢慢滴加入3. 02克的苯 甲酰氯，反應(yīng)液室溫?cái)嚢?4小時(shí)。蒸去一半的溶劑后，加入30mL的10% K2CO3水溶液，室溫 攪拌1小時(shí)。過濾收集沉淀，用水充分洗滌后再用少量的CH3CN洗滌，真空干燥。粗產(chǎn)品經(jīng)二 氧六環(huán)重結(jié)晶后得到1.40克的目標(biāo)化合物2，產(chǎn)率67%。1HNMR(CDCI3)測(cè)定結(jié)果8. 86 (d, J = 8. 4Hz，2H)，8. 79(s，2H)，8· 02 (t，J = 8. 0Ηζ，2Η)，7· 89 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，7· 76 (d, J = 7. 6Hz,2H)，7. 10 (d, J = 8. 4Hz,2H)，3. 92 (s, 3H)。 (3) 4，- (4-甲氧基苯基)-2，2， 6，，2 ” -聯(lián)三吡啶-6，6 ” - 二甲酸二甲酯(化合物 3)的合成 將1. 56克的化合物2(4. Ommol)加入50mL的40%氫溴酸與25mL的冰乙酸中， 110°c下攪拌反應(yīng)8小時(shí)后反應(yīng)液倒入200mL的冰水中，過濾收集沉淀，水充分洗滌后真空 干燥。將產(chǎn)物加入到含有在4. 77克氯化亞砜(40. Immol)的120mL甲醇溶液中，攪拌回流 18小時(shí)后，減壓蒸去溶劑，產(chǎn)物用飽和NaHCO3水溶液及純水洗滌后，真空干燥。粗產(chǎn)品經(jīng)二氧六環(huán)重結(jié)晶后得到1. 17克的目標(biāo)化合物3，產(chǎn)率64%。1HNMR(CDCI3)測(cè)定結(jié)果8. 84 (d, J = 8. 0Hz, 2H) ,8. 79(s，2H)，8· 19 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，8· 03 (t, J = 8. OHz, 2H) 7. 88 (d, J = 8. 8Hz，2H)，7. 06 (d, J = 8. 4Hz，2H)，4. 07(s，6H)，3. 90(s，3H)。(4) 6，6”-二羥甲基-4，-(4-甲氧基苯基)-2，2，:6，，2”-聯(lián)三吡啶(化合物4)的 合成將1. 50克的化合物3 (3. 3mmol)及0. 50克的NaBH4 (13. 2mmol)加入60mL的無水乙醇 中，反應(yīng)液室溫?cái)嚢?小時(shí)后，再回流攪拌8小時(shí)。減壓蒸除溶劑，加入IOmL的飽和NaHCO3 水溶液，回流攪拌10分鐘，反應(yīng)液倒入30mL的冰水中。過濾收集沉淀，用水充分洗滌后再 用少量的CH3CN洗滌，真空干燥，得到1.22克的目標(biāo)化合物4，產(chǎn)率93%。1HNMR(⑶Cl3)測(cè) 定結(jié)果8. 68(s，2H)，8· 58 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 89 (t, J = 8. OHz, 2H) ,7. 82 (d, J = 8. 4Hz, 2H)，7. 29 (d, J = 7. 6Hz，2H)，7. 08 (d, J = 8. 8Hz，2H)，4. 88(s，4H)，4. 06 (br, 2H), 3. 91 (s, 3H)。(5) 6，6”-二溴甲基-4，-(4-甲氧基苯基)-2，2，6，，2”_聯(lián)三吡啶(化合物5) 的合成將3. 65克PBr3 (13. 5mmol)加入70mL的干燥二甲基甲酰胺，室溫?cái)嚢?5分鐘后 加入2. 17克的化合物4(5. 4mmol)，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24小時(shí)。溶液中加入飽和NaHCO3水溶 液中和，過濾收集沉淀，用水充分洗滌后，再用少量ch3cn洗滌，真空干燥，得到2. 67克的 目標(biāo)化合物 5，產(chǎn)率 94%。1HNMr(CDCI3)測(cè)定結(jié)果8. 73 (s，2H)，8. 57 (d，J = 7.6Hz，2H)， 7. 86-7. 92(m，4H)，7. 51(d，J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 08 (d, J = 8. 8Ηζ，2Η)，4· 69 (s，4Η)，3· 91 (s， 3H)。(6) 6，6”-二溴甲基-4，- (4_羥基苯基)_2，2，6，，2”_聯(lián)三吡啶(化合物6)的 合成在0°C氬氣氛圍下將含有2. 82克BBr3 (11. 3mmol)的15mLCH2Cl2溶液慢慢滴加入 含有1. 48克的化合物5(2. 8mmol)的130mLCH2Cl2溶液中，反應(yīng)液在攪拌下逐漸升至室溫 并繼續(xù)攪拌過夜。滴加入80mL的冷水，攪拌30分鐘后，過濾收集沉淀，用水充分洗滌，真空 干燥。粗產(chǎn)品經(jīng)甲醇重結(jié)晶后得到0. 71克的目標(biāo)化合物6，產(chǎn)率49%。1HNMR(DMSO-CI6)測(cè) 定結(jié)果8. 67(s，2H)，8. 60 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，8· 08 (t, J = 8. 0Hz，2H)，7. 81 (d，J = 8. 4Hz, 2H),7. 71 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 02 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，4· 87(s，4H)。(7)4，-(4-羥基苯基)-2，2，:6，，2”-聯(lián)三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸乙酯(化合 物7)的合成在氬氣氛圍下將0. 13克NaH(5.4mm0l)加入到含有1.02克二乙酸乙酯基胺 (5. 4mmol)的60mL干燥CH3CN中，室溫?cái)嚢?5分鐘后加入1. 15克的化合物6 (2. 2mmol)。室 溫?cái)嚢?4小時(shí)后過濾收集濾液，蒸除溶劑，產(chǎn)物再溶于20mLCHCl3中，用20mL水洗滌CHCl3 溶液2次，無水Na2SO4干燥有機(jī)相，蒸除溶劑。粗產(chǎn)物用硅膠柱分離，淋洗劑為1 1的 石油醚-乙酸乙酯，產(chǎn)物再用1 5的乙醇-水重結(jié)晶得到0.67克的目標(biāo)化合物7，產(chǎn)率 41%。1HNMr(CDCI3)測(cè)定結(jié)果8. 61(s，2H)，8. 53(d，J = 7. 6Hz，2H)，7. 88 (t，J = 7. 6Hz, 2H)，7· 69(d, J = 8. 4Hz，2H)，7· 66(d, J = 8. 0Hz，2H)，7· 97(d, J = 8. 4Hz，2H)，4. 22(s，4H)， 4. 16 (q, J = 7. 2Hz，8H)，3. 70(s，8H)，1. 23 (t, J = 7. 2Hz, 12H)。(8)4，-[4-(3-氨基-4-硝基苯氧基)苯基]_2，2，6，，2” -聯(lián)三吡啶 _6，6” - 二 甲胺四乙酸乙酯(化合物8)的合成
在氬氣氛圍下將0.024克NaH(LOmmol)加入到含有0. 73克化合物7 (1. Ommol) 的35mL干燥CH3CN中，室溫?cái)嚢?5分鐘后加入0. 23克的5-氟-2-硝基苯胺(1. 5mmol)。 反應(yīng)液50°C下攪拌8小時(shí)，過濾收集濾液，蒸除溶劑，產(chǎn)物再溶于20mLCHCl3中，用2OmL水 洗滌CHCl3溶液2次，無水Na2SO4干燥有機(jī)相，蒸除溶劑。粗產(chǎn)物以2 1的石油醚-乙酸 乙酯為淋洗劑用硅膠柱分離純化，得到0.71克的目標(biāo)化合物8，產(chǎn)率82%。1HNMR(⑶Cl3)測(cè) 定結(jié)果8. 71(s，2H)，8. 56 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，8· 13 (d, J = 9. 6Ηζ，1Η)，7· 92 (d, J = 8. 4Hz, 2H)，7· 88 (t, J = 8. 0Hz，2H)，7· 65 (d, J = 7. 6Hz，2H)，7· 22 (d, J = 8. 0Hz，2H)，6· 39 (d, J = 9. 6Hz, 1H), 6. 35 (br, 2H), 6. 27 (s, 1Η), 4. 21 (s, 4Η), 4. 16 (q, J = 7· 2Hz，8Η)，3· 70 (s，8Η)， 1. 24 (t, J = 7. 2Hz, 12Η)。(9)4’ -[4_(3，4-二氨基苯氧基)苯基]_2，2，6，，2”-聯(lián)三吡啶 _6，6” - 二甲胺 四乙酸乙酯(化合物9)的合成將0. 82克化合物8(0. 95mmol)溶于40mL乙醇后加入0. 05克10%的Pd/C催化 劑，在氬氣氛圍下滴加入20mL含有1. 0克NaH2PO2 (11. 4mmol)的水溶液，反應(yīng)液攪拌回流6 小時(shí)，過濾除去Pd/C催化劑，濾液減壓蒸去溶劑，產(chǎn)物再溶于20mL的CHCl3中，用20mL水洗 滌CHCl3溶液2次，無水Na2SO4干燥有機(jī)相，蒸除溶劑。粗產(chǎn)物以1 5的石油醚-乙酸乙 酯為淋洗劑用硅膠柱分離純化，得到0. 46克的目標(biāo)化合物9，產(chǎn)率58%。1HNMR(⑶Cl3)測(cè) 定結(jié)果8. 68(s，2H)，8· 54 (d, J = 8. OHz, 2H) ,7. 86 (t, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 83 (d, J = 8. 8Hz, 2H)，7· 63(d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 09(d, J = 8. 8Hz，2H)，6· 72(d, J = 8. OHz, 1H)，6· 50 (s, 1H)，
6.46 (d, J = 8. OHz, 1Η)，4· 19(s，4H)，4· 16 (q, J = 7. 2Ηζ，8Η)，3· 70(s，8H)，1. 23 (t, J =
7.2Hz,12Η)。(IO)DATTA 的合成在氬氣氛圍下將0. 46克的化合物9 (0. 55mmol)加入0. 93克K0H_20mL乙醇_5mL 水的溶液中，室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，減壓蒸去溶劑，產(chǎn)物再溶于15mL水中，用1. Omol/L的鹽 酸調(diào)節(jié)溶液的PH值到2-3，室溫?cái)嚢?小時(shí)。過濾收集沉淀，用水洗滌后真空干燥。將產(chǎn) 物加入20mL的干燥CH3CN中，攪拌回流10分鐘，過濾收集沉淀真空干燥，得到0. 24克的 目標(biāo)化合物 DATTA，產(chǎn)率 60%。1MR(DMSO-Cl6)測(cè)定結(jié)果8. 65 (s，2H)，8. 53 (d，J = 7. 6Hz, 2H)，8. 01(t，J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 89 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，7· 62 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 08 (d, J =8. 4Ηζ，2Η)，6. 59 (d, J = 8. 4Hz, 1Η)，6. 35 (s, 1Η)，6. 22 (d, J = 8. 4Hz, 1Η)，4. 10(s，4H)， 3. 57(s，8H)。13CNMR (DMS0-d6)測(cè)定結(jié)果:172· 93，160. 6，159. 05，156. 0，154. 80，149. 25， 147. 72，138. 42，137. 53，131. 17，128. 79，123. 89，119. 83，117.85，115.99，108.74，106.89， 59. 54，54. 91。元素分析測(cè)定結(jié)果計(jì)算值(C37H35N7O9 · 1. 5H20) =C = 59. 35%,H = 5. 12%, N = 13. 09% ；測(cè)定值C = 58. 96%，Η = 5. 08%，Ν = 12. 94%。質(zhì)譜(ESI-MS)測(cè)定結(jié)果 m/z = 720. 2[Μ-ΗΓ。實(shí)施例2 =DATTA的乙酸亞甲基酯(簡稱AM-DATTA)的合成在氬氣氛圍下將11. 58毫克的DATTA · 1. 5Η20(15. 5 μ mol)溶于193微升的二甲 基亞砜中，加入61微升的乙酸溴甲基酯(618 μ mol)及89微升的三乙基胺(617 μ mol)，溶 液室溫下攪拌14小時(shí)，離心除去微量的不溶物后，上清液即為AM-DATTA的溶液，4°C保存待 用。質(zhì)譜(ESI-MS)測(cè)定結(jié)果m/z = 1009.8，[M+H]+。實(shí)施例3 =DATTA與NO反應(yīng)產(chǎn)物(簡稱BPTTA)的合成
8
(1)4，-[4_(苯并三唑-6-氧)苯基]_2，2，6，，2” -聯(lián)三吡啶_6，6” - 二甲胺四 乙酸乙酯(化合物10)的合成將430 毫克 4，- [4- (3，4_ 二氨基苯氧基)苯基]_2，2，:6，，2 ”-聯(lián)三吡啶 _6，6，，- 二 甲胺四乙酸乙酯(實(shí)施例1中化合物9，0. 52mmol)溶于含有63毫克乙酸的4mL水中，5°C 下滴加入含有43毫克NaNO2 (0. 62mmol)的2mL水溶液，5°C下攪拌10分鐘后再室溫?cái)嚢? 小時(shí)。反應(yīng)液中加入20mL的CHCl3攪拌10分鐘，分出有機(jī)相。用20mL水洗滌CHCl3溶液 2次，無水Na2SO4干燥有機(jī)相，蒸除溶劑。粗產(chǎn)物以1 2的石油醚-乙酸乙酯為淋洗劑用 硅膠柱分離純化，得到171毫克的目標(biāo)化合物，產(chǎn)率39%。1HNMR(⑶Cl3)測(cè)定結(jié)果8. 64(s, 2H)，8· 54 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 93 (d, J = 8. 8Hz, 1Η)，7· 85 (t, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 79 (d, J =8. 4Ηζ，2Η)，7· 60 (d, J = 7. 6Ηζ，2Η)，7· 34 (s，1Η)，7· 17 (d, J = 7. 6Hz, 1Η)，7· 12 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，4· 22(s，4H)，4· 15 (q, J = 7. 2Ηζ，8Η)，3· 71(s，8H)，1. 20 (t, J = 7. 2Hz, 12Η)。(2)4，-[4_(苯并三唑-6-氧)苯基]_2，2，6，，2” -聯(lián)三吡啶_6，6” - 二甲胺四 乙酸(BPTTA)的合成將171毫克的化合物10 (0. 20mmol)加入336毫克K0H_20mL乙醇_5mL水的溶液 中，室溫?cái)嚢?4小時(shí)后，減壓蒸去溶劑，產(chǎn)物再溶于15mL水中，用1. Omol/L的鹽酸調(diào)節(jié) 溶液的PH值到2-3，室溫?cái)嚢?小時(shí)。過濾收集沉淀，用水洗滌后真空干燥。將產(chǎn)物加入 IOmL的干燥CH3CN中，攪拌回流10分鐘，過濾收集沉淀真空干燥，得到56毫克的目標(biāo)化 合物 BPTTA，產(chǎn)率 38%。1HnMR(DMSO-CI6)測(cè)定結(jié)果8. 71 (s，2H)，8. 58 (d，J = 7. 6Ηζ,2Η), 8. 07-8. 00(m，5H)，7· 66 (d, J = 7. 6Hz，2H)，7· 54 (s，1H)，7· 28-7. 26(m，3H)，4· 20(s，4H)， 3. 68(s，8H)。13CNMR(DMS0-d6)測(cè)定結(jié)果172. 55，158. 75，158. 23，156. 02，154. 66，149. 10， 138. 63，133. 02，129. 29，128. 67，124. 13，120. 05，119. 54，118. 14，59. 49，54. 90。元素分析 測(cè)定結(jié)果計(jì)算值(C37H32N8O9 · 4H20) =C = 55. 20%,H= 5.01%,N= 13. 92% ；測(cè)定值C = 55. 41%, H = 4. 88%, N = 14. 12%0 質(zhì)譜(ESI-MS)測(cè)定結(jié)果:m/z = 731. 3[Μ_ΗΓ。實(shí)施例4 探針DATTA-Eu3+及其與NO反應(yīng)產(chǎn)物BPTTA-Eu3+的性質(zhì)測(cè)定(1)光譜性質(zhì)用ρΗ值為7. 4的0. 05mol/L硼酸緩沖溶液作為溶劑測(cè)定了配合物DATTA-Eu3+及 BPTTA-Eu3+(兩種配合物中配位體與金屬離子的摩爾比為1 1)的紫外可見光譜、熒光光 譜、摩爾消光系數(shù)(ε)、熒光量子收率(φ)及熒光壽命(τ)。紫外可見光譜測(cè)定用儀器為 Perkin Elmer Lambda 35型分光光度計(jì)，熒光測(cè)定儀器為Perkin Elmer LS 50B熒光分光 光度計(jì)，熒光量子產(chǎn)率使用4’ -苯基_2，2，6’，2”_聯(lián)三吡-6，6”_ 二甲胺四乙酸與Eu3+ 及Tb3+的配合物作為標(biāo)準(zhǔn)物按文獻(xiàn)方法測(cè)得(文獻(xiàn)16 :M. Latva, H. Takalo, J. Kankare, J. Lumin. 1997,75,149)。測(cè)定結(jié)果見表 1。表1. DATTA-Eu3+及BPTTA-Eu3+在硼酸緩沖溶液中的吸收及熒光性質(zhì)
化合物最大吸收波 長(nm)^326 nm (Cm-1Iiior1L)最大發(fā)光波 長(nm)Φ (%)熒光壽命 (ms)DATTA-Eu3+292,3262.03χ1046120.251.08BPTTA-Eu3+293,3262.05χ10461211.81.30
9
由表1可見，探針DATTA-Eu3+與NO反應(yīng)前后其熒光量子產(chǎn)率發(fā)生了很大的變化， DATTA-Eu3+的熒光量子產(chǎn)率只有0. 25%，而BPTTA-Eu3+的熒光量子產(chǎn)率達(dá)到了 11. 8%，表 明探針DATTA-Eu3+與NO反應(yīng)后其量子產(chǎn)率增加了 47倍。DATTA-Eu3+與NO的化學(xué)反應(yīng)式 如圖2所示，兩種化合物的熒光光譜如圖3所示。(2)溶液pH值對(duì)DATTA-Eu3+及BPTTA-Eu3+熒光性質(zhì)的影響用不同pH值的0. 05mol/L的硼酸緩沖溶液作為溶劑測(cè)定了配合物DATTA-Eu3+及 BPTTA-Eu3+在不同pH值下的熒光強(qiáng)度與熒光壽命，結(jié)果見圖4及圖5。由圖4可見，當(dāng)pH大 于6時(shí)，DATTA-Eu3+的熒光非常微弱且穩(wěn)定，但當(dāng)pH小于6時(shí)，DATTA-Eu3+的熒光隨著溶液 酸度的增加而逐漸變強(qiáng)，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是在酸性溶液中DATTA的2個(gè)氨基可發(fā)生質(zhì) 子化反應(yīng)，導(dǎo)致其對(duì)銪配合物發(fā)光部位的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移消光作用減弱。與DATTA-Eu3+相 比，BPTTA-Eu3+在pH小于6的溶液中可發(fā)出很強(qiáng)的熒光且強(qiáng)度不受pH的影響，但當(dāng)pH大 于6時(shí)，BPTTA-Eu3+的熒光隨著溶液酸度的減小而逐漸變?nèi)?，這是由于在堿性溶液中BPTTA 的三唑環(huán)上的氫可發(fā)生電離形成三唑環(huán)負(fù)離子，導(dǎo)致其對(duì)銪配合物發(fā)光部位的光誘導(dǎo)電子 轉(zhuǎn)移消光作用增強(qiáng)?？傮w來看，在生理PH值范圍內(nèi)，BPTTA-Eu3+與DATTA-Eu3+的熒光強(qiáng)度 比值很大(在pH = 6. 5和pH = 7. 4時(shí)兩者的熒光強(qiáng)度比值分別為50. 5和47. 4)，說明 DATTA-Eu3+可作為熒光探針用于生理?xiàng)l件溶液中NO的高靈敏測(cè)定。另外，圖5結(jié)果說明 DATTA-Eu3+及BPTTA-Eu3+的熒光壽命基本不受溶液pH值的影響。 (3)探針DATTA-Eu3+對(duì)NO測(cè)定的選擇性分別考察了活性物種H2O2、· 0H、0C1_、單線態(tài)氧(1O2)、N02_、N03_、0N00_、02_ 以及 NO 與探針DATTA-Eu3+的反應(yīng)情況，在相同濃度與反應(yīng)條件(所有反應(yīng)都在0. 05mol/L的pH值 7. 4的硼酸緩沖溶液中室溫下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)，DATTA-Eu3+濃度=0. 1 μ mol/L ；活 性物種濃度= ο μ mol/L)下9種活性物種與DATTA-Eu3+反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果如 圖6所示(測(cè)定儀器為PerkinElmer Victor 1420時(shí)間分辨熒光測(cè)定儀)。由圖6可見， 探針DATTA-Eu3+與H2O2、· OH、0ClV02、N02_、N03_、0N00_、02_反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度沒有發(fā)生明 顯變化，表明DATTA-Eu3+不與這些活性物種發(fā)生反應(yīng)。當(dāng)DATTA-Eu3+與NO反應(yīng)后，由于形 成了強(qiáng)熒光性的BPTTA-Eu3+，導(dǎo)致探針的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。上述結(jié)果表明探針DATTA-Eu3+ 對(duì)NO測(cè)定具有很好的選擇性。實(shí)施例5 使用DATTA-Eu3+測(cè)定水溶液中NO的濃度在pH值為7. 4的0. 05mol/L硼酸緩沖溶液中分別加入DATTA-Eu3+(0. 1 μ mol/L)和 不同濃度的N0，攪拌反應(yīng)0.5小時(shí)后測(cè)定熒光強(qiáng)度。測(cè)定用儀器為Perkin Elmer LS 50B 熒光分光光度計(jì)，測(cè)定結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，伴隨著NO濃度的增加，探針的熒 光強(qiáng)度也逐漸增加，表明DATTA-Eu3+可用于定量測(cè)定溶液中生成的NO的濃度。圖8給出了使用DATTA-Eu3+檢測(cè)NO的工作曲線(測(cè)定儀器為Perkin ElmerVictor 1420時(shí)間分辨熒光測(cè)定儀)。如圖所示，NO的濃度與熒光強(qiáng)度具有很好的線性關(guān)系，用本 底信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍計(jì)算最低檢出限為8. 4nmol/L，表明使用DATTA-Eu3+定量檢測(cè)NO具 有很高的靈敏度。實(shí)施例6 探針DATTA-Eu3+用于植物細(xì)胞中內(nèi)源性NO的熒光成像測(cè)定將培養(yǎng)中的桅子細(xì)胞過濾收集后加入到含有200 μ mol/L的AM-DATTA及 200 μ mol/L的EuCl3的等滲鹽溶液中形成密度為每毫升1. 7 X IO5細(xì)胞的懸浮液，在室溫下振蕩培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間取一定量的細(xì)胞液在4°C下每分鐘600轉(zhuǎn)離心5分鐘后，用等滲 鹽溶液充分洗滌除去未進(jìn)入細(xì)胞的配合物，將洗滌后的細(xì)胞置于載玻片上進(jìn)行明場(chǎng)成像、 熒光成像及時(shí)間分辨熒光成像測(cè)定(測(cè)定用儀器為配有時(shí)間分辨熒光成像功能的Nikon TE2000-E 型倒置式熒光顯微鏡，見文獻(xiàn) 17 :B. Song, G. L. Wang，Μ. Q. Tan, J. L. Yuan, J. Am. Chem. Soc. 2006，128，13442)。 圖9給出了不同培養(yǎng)時(shí)間下桅子細(xì)胞的成像測(cè)定結(jié)果，由圖可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間 的增加，細(xì)胞發(fā)出的熒光也明顯增強(qiáng)，表明在培養(yǎng)過程中桅子細(xì)胞內(nèi)可持續(xù)產(chǎn)生NO。通過對(duì) 細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核區(qū)域的熒光強(qiáng)度要明顯高于細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，說明 植物細(xì)胞內(nèi)NO的生成發(fā)生在細(xì)胞核區(qū)域。另外，與常規(guī)熒光成像結(jié)果比較可以發(fā)現(xiàn)，時(shí)間 分辨熒光成像中不存在細(xì)胞的背景熒光，表明時(shí)間分辨熒光成像測(cè)定方式可有效消除生物 樣品背景熒光對(duì)測(cè)定的干擾。
權(quán)利要求
一種基于銪配合物的一氧化氮熒光探針，其特征在于以三價(jià)銪離子與有機(jī)配位體4’ [4 (3，4 二氨基苯氧基)苯基] 2，2’6’，2” 聯(lián)三吡啶 6，6” 二甲胺四乙酸形成的配合物為一氧化氮熒光探針，其中所述有機(jī)配位體結(jié)構(gòu)式為。FDA0000023363620000011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于銪配合物的一氧化氮熒光探針，其特征在于與細(xì) 胞共培養(yǎng)進(jìn)入細(xì)胞的三價(jià)銪離子與有機(jī)配位體4’ _[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]_2，2’: 6’，2”_聯(lián)三吡啶-6，6”_ 二甲胺四乙酸的乙酸亞甲基酯形成的配合物為一氧化氮熒光探 針，其中所述有機(jī)配位體結(jié)構(gòu)式為
3.權(quán)利要求1或2所述一氧化氮熒光探針的應(yīng)用，其特征在于在各類生物及非生物 體系中，利用所述的銪配合物熒光探針與體系中的NO特異性反應(yīng)，使得探針的熒光發(fā)光顯 著增強(qiáng)，然后通過熒光測(cè)定法來確定NO的生成量及分布情況；所述熒光測(cè)定法包括常規(guī)的 熒光分光光度計(jì)測(cè)定法、時(shí)間分辨熒光分光光度計(jì)測(cè)定法、熒光顯微鏡成像測(cè)定法或時(shí)間 分辨熒光熒光顯微鏡成像測(cè)定法。
4.根據(jù)3所述的應(yīng)用，其特征在于所述一氧化氮測(cè)定用銪配合物熒光探針用于含有 其組份的測(cè)定試劑盒及相關(guān)試劑中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可用于一氧化氮特異性熒光測(cè)定的新型銪配合物熒光探針及其應(yīng)用。該探針是以三價(jià)銪離子與有機(jī)配位體4’-[4-(3，4-二氨基苯氧基)苯基]-2，2’6’，2”-聯(lián)三吡啶-6，6”-二甲胺四乙酸形成的配合物(簡稱DATTA-Eu3+)，其中所述有機(jī)配位體結(jié)構(gòu)式為該探針在生理pH值的含氧水溶液中可以特異性地與一氧化氮反應(yīng)，導(dǎo)致探針的熒光強(qiáng)度增加47倍以上，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)體系中一氧化氮的選擇性熒光測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101921586SQ20101022816
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者葉志強(qiáng), 王桂蘭, 袁景利, 陳永剛 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)