專利名稱：一種羥基自由基的電化學分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于羥基自由基的分析測試技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羥基自由基的電化學 分析方法。
背景技術(shù)：
活性氧(ROS)是一類化學性質(zhì)比氧氣更活潑的氧的代謝產(chǎn)物及含氧衍生物，主要 包括過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(02‘_)、羥基自由基(·0Η)、單線態(tài)氧(1O2)、過氧化自由基 (R00’)以及一氧化氮(NO)等，其中以·0Η的活性最高?！?Η的實時在線檢測，對于研究TiO2 光催化和生命有機體的各種生理、病理反應(yīng)(如癌癥、機體炎癥、組織過氧化、蛋白質(zhì)交聯(lián) 變性、DNA損傷和信號傳導等)有良好的應(yīng)用前景。自由基生物學最早出現(xiàn)于50年代初期，但由于當時借助的是電子自旋共振儀來 研究自由基，其儀器昂貴，難于普及，阻礙了這一學科的發(fā)展。直到1969年J. Μ. McCord 和I. J. Fridovich (Biol. Chem.，1969，244，6049)發(fā)現(xiàn)了清除超氧化物自由基的超氧物 岐化酶(SOD)并研究了其生物學作用。由于分子生物學的迅猛發(fā)展，研究短壽命的自由 基的方法有所突破，1969 年 F. Gerson 在 Electron Spin Resonance Spectroscopy of Organic Radicals —書中報道了電子順磁共振波譜法檢測脂質(zhì)過氧化自由基(R00·)的 技術(shù)，1992年N. Chakraborty (Plant Physiol, 1992，98，7)中報導了利用分光光度法檢測 1O2 的方法，2007 年 F. Scholz (Angew. Chem.，2007，119，8225)報導了電化學方法檢測· OH 的技術(shù)。近代對活性氧的檢測雖有較大進展，然而，由于活性氧具有反應(yīng)活性高、壽命短 等特點，迫切需要設(shè)計一種簡便、靈敏、有選擇性地實時在線檢測活性氧的方法。1969年 G. G. Guilbualt (Anal. Chem.，1967，39，271)報導了熒光分光光度法檢測細胞中H2O2的方 法，但由于細胞中‘0H的壽命很短，會很快轉(zhuǎn)變成H2O2，因此該方法不能選擇性的檢測細胞中 的.0H。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種羥基自由基的電化學分析方法，該方法基于電化學交 流阻抗技術(shù)表征疏水性長鏈脂肪烴單分子自組裝修飾電極的電荷傳遞電阻，可實時在線檢 測羥基自由基，并且可選擇性檢測無機體系和生物體有機體系中的‘ 0H。本發(fā)明的內(nèi)容為一種羥基自由基的電化學分析方法，具體步驟如下(1)超疏水單分子自組裝膜的制備將經(jīng)過前處理的ITO導電玻璃作為工作電極，鉬絲為對電極，飽和Ag/AgCl電極為 參比電極，在20-40mmol/L的氯金酸溶液中于_0. 08V下沉積5-30min，得到納米金修飾電 極；將納米金電極浸泡在含巰基的長鏈脂肪烴的乙醇溶液中修飾，制得超疏水自組裝單分 子層；(2)光催化劑TiO2膜的制備將銳鈦礦TiO2溶膠通過旋涂法修飾在經(jīng)過前處理的ITO玻璃上，并在723K下燒結(jié) lh，得到 TiO2 膜即 Ti02/IT0 ；(3) · OH對超疏水自組裝單分子層的降解將步驟(1)制得的超疏水自組裝單分子層與步驟(2)制得的TiO2膜正面相對，兩 者面積均取0. 3-1. Ocm2,借助墊片使其間距為10-2000 μ m,用紫外光從Ti02/IT0背面一側(cè) 照射不同的時間段，直至超疏水自組裝單分子層降解完全，利用非接觸TiO2光催化過程產(chǎn) 生的‘ OH降解超疏水自組裝單分子層；(4) ESI表征超疏水自組裝單分子層表面R。t的變化以修飾有超疏水自組裝單分子層的Au電極為工作電極，在含有IOmmol/ UFe(CN)6]3*的0. lmol/L KCl溶液中，通過EIS方法表征[Fe (CN) 6] 氧化還原探針在 步驟(3)所述的不同光照時間里修飾有超疏水自組裝單分子層的Au電極表面的電荷轉(zhuǎn)移 電阻R。t;(5)熒光光度法定量非接觸TiO2光催化產(chǎn)生的· OH將Ti02/IT0與玻璃組裝成一個含有進氣管和出氣管的長方體密閉裝置，其底面積 與TiO2膜面積相等，高與超疏水自組裝單分子層和TiO2膜之間距離相等，且TiO2膜一側(cè)在 密閉裝置內(nèi)；紫外光從Ti02/IT0背面照射，控制進氣管以l-5ml/min的速度通入空氣，將出 氣管導入收集液中，室溫下反應(yīng)10-30min，用熒光光度法定量不同時間生成的H2O2，確定非 接觸TiO2光催化過程中生成的‘ OH的量；其中，所述收集液含有三羥甲基氨基甲烷緩沖液、高香草酸(HVA)和辣根過氧化 物酶；(6) ESI 間接檢測· OH建立步驟(4)中不同光照時間后[Fe (CN)6] 在修飾有超疏水自組裝單分子層 的Au電極表面Ret的變化與步驟(5)中在相同實驗條件下生成的‘0H的物質(zhì)的量之間的對 應(yīng)關(guān)系，通過ESI檢測非接觸TiO2光催化和巨噬細胞中產(chǎn)生的‘ OH的量。本發(fā)明中，步驟(1)和步驟(2)中銦錫氧化物(ITO)導電玻璃的前處理過程為分 別在去離子水、乙醇、lmol/L的KOH水溶液中依次超聲清洗半小時后，用去離子水洗凈并吹 干。本發(fā)明中，步驟(1)中使用的含巰基的長鏈脂肪烴為十八烷基硫醇(ODT)，溶液為 濃度為Immo 1/L，修飾ODT的時間為7_12h。較佳的，本發(fā)明中步驟(3)超疏水自組裝單分子層與TiO2膜正面相對的距離為 50 μ m,面積為1cm2，紫外光強度為7. 6mff/cm2,光照時間為0-380min，即從ODT剛剛開始降 解到被降解完全。本發(fā)明的有益效果在于該方法具有較高的選擇性和靈敏度，其線性范圍為1. 8 43. 8nmol，最低檢測線 為1. Snmol，可以原位檢測細胞中產(chǎn)生的‘ 0H,也可選擇性檢測無機體系和生物體有機體系 中的·0Η。


圖1是交流阻抗技術(shù)檢測非接觸TiO2光催化過程中‘ OH機理的示意圖；圖2是收集非接觸TiO2光催化過程中的H2O2的示意圖3是實施例lODT/Au電極在非接觸TiO2光催化過程中反應(yīng)不同時間的交流阻 抗圖，其中a線是Omin，b線是30min，c線是60min，，d線是180min，，e線是240min，，f線 是300min，，g線是360min，h線是金電極，小圖是[Fe (CN) 6] 在ODT/Au表面Rct的減小 百分比與‘0H的物質(zhì)的量之間的線性關(guān)系圖；圖4是實施例1檢測細胞中‘OH的交流阻抗圖，其中a線是ODT/Au電極與細胞 中‘0H反應(yīng)后的交流阻抗線，b線是ODT/Au電極與細胞中‘0H反應(yīng)后的交流阻抗線。
具體實施例方式下面的實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是限制本發(fā)明的范圍。實施例1檢測小鼠白血病巨噬細胞(RAW264. 7)產(chǎn)生的· OH(1)超疏水自組裝單分子層的制備如圖1所示，將銦錫氧化物(ITO)導電玻璃分別用去離子水、乙醇、lmol/L的KOH 水溶液超聲清洗半小時，去離子水洗凈并吹干。將此ITO導電玻璃作為工作電極，鉬絲為對 電極，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，于40mmol/L的氯金酸溶液中在_0. 08V下沉積5min， 得到納米金電極。將納米金電極浸泡在ODT的乙醇溶液中(lmmol/L)，修飾12h，得到ODT/ Au超疏水界面。(2)光催化劑TiO2膜的制備將ITO導電玻璃分別用去離子水、乙醇、lmol/L的KOH水溶液超聲清洗半小時，去 離子水洗凈并吹干。將銳鈦礦納米TiO2溶膠通過旋涂法修飾在ITO玻璃上，并在723K下 燒結(jié)lh，得到超親水納米Ti02/IT0膜。(3) ’ OH對超疏水自組裝單分子層的降解借助墊片使面積均為Icm2的ODT/Au與Ti02/IT0保持50 μ m距離，正面相對。在 室溫、空氣相對濕度為60%條件下，用7. 6mW/cm2紫外光(UV light)從Ti02/IT0背面一側(cè) 分別光照 15、30、45、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、38011^11，利用該非接 觸TiO2光催化體系產(chǎn)生的‘ OH降解ODT自組裝單分子層。(4) ESI表征超疏水自組裝單分子層表面R。t的變化以O(shè)DT/Au電極為工作電極，鉬絲為對電極，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，在含有 IOmM[Fe (CN)6ΓΛ-的0. lmol/L KCl溶液中，通過EIS方法表征[Fe (CN)6]3*氧化還原探針 上述光照不同時間下ODT/Au電極表面的電荷轉(zhuǎn)移電阻。(5)熒光光度法定量非接觸TiO2光催化產(chǎn)生的‘ OH如圖2所示，通過墊片將Ti02/IT0與玻璃組裝成一個內(nèi)部體積為 IcmX lcmX50 μ m的含有進氣管和出氣管的密閉裝置，TiO2膜朝向密閉裝置內(nèi)。用7. 6mW/ cm2紫外光從Ti02/IT0背面一側(cè)光照，光照面積為1 X Icm2，控制進氣管以2ml/min的速度通 入室溫、相對濕度為60%的空氣，將出氣管導入含0. lmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH =8. 50), 2. 5mmol/L高香草酸(HVA)和2. 0U/ml的辣根過氧化物酶(HRP)的3ml搜集液 中，室溫下反應(yīng)30min。基于HRP催化過氧化氫(H2O2)氧化HVA生成能產(chǎn)生熒光的二聚體， 在激發(fā)波長λεχ為313nm、發(fā)射波長λ em為425nm下，用熒光方法檢測紫外光照不同時間生 成的H2O2，根據(jù)雙激發(fā)原理2 · 0H)確定生成的‘0H的物質(zhì)的量。(6) ESI 間接檢測· OH
如圖3所示，根據(jù)得到的不同光照時間下恤(0幻6]3-/4-在0017^11表面R。t的變化 與相同實驗參數(shù)下生成的‘0H的物質(zhì)的量，確定二者之間的對應(yīng)關(guān)系。以O(shè)DT/Au電極為工 作電極，鉬絲為對電極，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，在含有1 XlO6nIr1RAWZei 7細胞、 10馳[卩6化吣6]3"4-、100_01/1葡糖糖和0. lmol/L KCl 溶液中表征[Fe (CN) 6] 3- 在 ODT/Au 電極表面的R。t，然后加入脂多糖(LPS，在氧氣充足的情況下刺激細胞產(chǎn)生大量)，使其最終 濃度為500ng/ml，410K下反應(yīng)半小時，EIS表征[Fe (CN) 6] 在ODT/Au電極表面Rct。與沒加入LPS前相比，Ret減小了 34.47 %。由圖3可推知細胞產(chǎn)生的·OH為 15. 5nmoL·圖4是[Fe (CN) 6] 條在ODT/Au電極表面Ret變化圖。實施例2檢測小鼠白血病巨噬細胞(RAW264. 7)產(chǎn)生的· OH(1)超疏水自組裝單分子層的制備如圖1所示，將銦錫氧化物(ITO)導電玻璃分別用去離子水、乙醇、lmol/L的KOH 水溶液超聲清洗半小時，去離子水洗凈并吹干。將此ITO導電玻璃作為工作電極，鉬絲為對 電極，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，于20mmol/L的氯金酸溶液中在_0. 08V下沉積30min， 得到納米金電極。將納米金電極浸泡在ODT的乙醇溶液中(lOmmol/L)，修飾lh，得到ODT/ Au超疏水界面。(2)光催化劑TiO2膜的制備將ITO導電玻璃分別用去離子水、乙醇、lmol/L的KOH水溶液超聲清洗半小時，去 離子水洗凈并吹干。將銳鈦礦納米TiO2溶膠通過旋涂法修飾在ITO玻璃上，并在723K下 燒結(jié)lh，得到超親水納米Ti02/IT0膜。(3) ’ OH對超疏水自組裝單分子層的降解借助墊片使面積均為Icm2的ODT/Au與Ti02/IT0保持50 μ m距離，正面相對。在 室溫、空氣相對濕度為60%條件下，用7. 6mW/cm2紫外光(UV light)從Ti02/IT0背面一側(cè) 分別光照 15、30、45、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、38011^11，利用該非接 觸TiO2光催化體系產(chǎn)生的‘ OH降解ODT自組裝單分子層。(4) ESI表征超疏水自組裝單分子層表面R。t的變化以O(shè)DT/Au電極為工作電極，鉬絲為對電極，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，在含有 5mM[Fe (CN)6]3*的0. lmol/L KCl溶液中，通過EIS方法表征[Fe (CN)6]氧化還原探針 上述光照不同時間下ODT/Au電極表面的電荷轉(zhuǎn)移電阻。(5)熒光光度法定量非接觸TiO2光催化產(chǎn)生的‘ OH如圖2所示，通過墊片將Ti02/IT0與玻璃組裝成一個內(nèi)部體積為 IcmX lcmX50 μ m的含有進氣管和出氣管的密閉裝置，TiO2膜朝向密閉裝置內(nèi)。用7. 6mW/ cm2紫外光從Ti02/IT0背面一側(cè)光照，光照面積為1 X Icm2，控制進氣管以2ml/min的速度通 入室溫、相對濕度為60%的空氣，將出氣管導入含0. lmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH =8. 50), 2. 5mmol/L高香草酸(HVA)和2. 0U/ml的辣根過氧化物酶(HRP)的3ml搜集液 中，室溫下反應(yīng)30min?；贖RP催化過氧化氫(H2O2)氧化HVA生成能產(chǎn)生熒光的二聚體， 在激發(fā)波長λεχ為313nm、發(fā)射波長λ em為425nm下，用熒光方法檢測紫外光照不同時間生 成的H2O2，根據(jù)雙激發(fā)原理· 0Η)確定生成的‘0Η的物質(zhì)的量。(6) ESI 間接檢測· OH如圖3所示，根據(jù)得到的不同光照時間下[Fe (CN)6]3"4-在ODT/Au表面R。t的變化與相同實驗參數(shù)下生成的‘0H的物質(zhì)的量，確定二者之間的對應(yīng)關(guān)系。以O(shè)DT/Au電極為工 作電極，鉬絲為對電極，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，在含有1 XlO6nIr1RAWZei 7細胞、 10馳[卩6化吣6]3"4-、100_01/1葡糖糖和0. lmol/L KCl 溶液中表征[Fe (CN) 6] 3- 在 ODT/Au 電極表面的R。t，然后加入脂多糖(LPS，在氧氣充足的情況下刺激細胞產(chǎn)生大量)，使其最終 濃度為 500ng/ml，410K 下反應(yīng) 20min，EIS 表征[Fe (CN) 6] “4-在 ODT/Au 電極表面 Rct。
與沒加入LPS前相比，Ret減小了 25. 1%。由圖3可推知細胞產(chǎn)生的·OH為 11. 2nmol。
權(quán)利要求
一種羥基自由基的電化學分析方法，其特征在于具體步驟如下(1)超疏水單分子自組裝膜的制備將經(jīng)過前處理的ITO導電玻璃作為工作電極，鉑絲為對電極，飽和Ag/AgCl電極為參比電極，在20 40mmol/L的氯金酸溶液中于 0.08V下沉積5 30min，得到納米金修飾電極；將納米金電極浸泡在含巰基的長鏈脂肪烴乙醇溶液中，制得超疏水單分子自組裝膜；(2)光催化劑TiO2膜的制備將銳鈦礦TiO2溶膠通過旋涂法涂覆在經(jīng)過前處理的ITO玻璃上，并在723K下燒結(jié)1h，得到TiO2膜；(3)·OH對超疏水單分子自組裝膜的降解將步驟(1)制得的超疏水單分子自組裝膜與步驟(2)制得的TiO2膜正面相對，兩者面積均取0.3 1.0cm2，借助墊片使其間距為10 2000μm，用紫外光從TiO2膜背面照射不同的時間段，直至超疏水單分子自組裝膜完全降解，利用非接觸TiO2光催化過程產(chǎn)生的·OH降解超疏水單分子自組裝膜層；(4)ESI表征超疏水單分子自組裝膜表面Rct的變化以修飾有超疏水單分子自組裝膜電極為工作電極，在含有5 10mmol/L[Fe(CN)6]3 /4 的0.1mol/L KCl溶液中，通過EIS方法表征[Fe(CN)6]3 /4 氧化還原探針在步驟(3)所述的不同光照時間里修飾有超疏水單分子自組裝膜電極表面的電荷轉(zhuǎn)移電阻Rct；(5)熒光光度法定量非接觸TiO2光催化產(chǎn)生的·OH將TiO2膜與玻璃組裝成一個含有進氣管和出氣管的長方體密閉裝置，其底面積與TiO2膜面積相等，高與超疏水自組裝單分子層和TiO2膜之間距離相等，且TiO2膜一側(cè)在密閉裝置內(nèi)；紫外光從TiO2膜背面照射，控制進氣管以1 5ml/min的速度通入空氣，將出氣管導入收集液中，室溫下反應(yīng)10 30min，用熒光光度法定量不同時間生成的H2O2，確定非接觸TiO2光催化過程中生成的·OH的量；其中，所述收集液含有三羥甲基氨基甲烷緩沖液、高香草酸HVA和辣根過氧化物酶；(6)ESI間接檢測·OH建立步驟(4)中不同光照時間后[Fe(CN)6]3 /4 在修飾有超疏水單分子自組裝膜電極表面Rct的變化與步驟(5)中在相同實驗條件下生成的·OH物質(zhì)的量之間的對應(yīng)關(guān)系，通過ESI檢測非接觸TiO2光催化和巨噬細胞中產(chǎn)生的·OH的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羥基自由基的電化學分析方法，其特征在于步驟(1)和 步驟(2)中銦錫氧化物即ITO導電玻璃的前處理過程為分別在去離子水、乙醇、lmol/L的 KOH水溶液中依次超聲清洗半小時后，用去離子水洗凈并吹干。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羥基自由基的電化學分析方法，其特征在于步驟(1)中 使用的含巰基的長鏈脂肪烴為十八烷基硫醇，溶液為濃度為lmmol/L，修飾十八烷基硫醇的 時間為l_24h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羥基自由基的電化學分析方法，其特征在于步驟(3)超 疏水單分子自組裝膜與TiO2膜正面相對的距離為50 μ m,面積為1cm2，紫外光強度為7. 6mff/ cm2，光照時間為0-380min。
全文摘要
本發(fā)明屬于羥基自由基分析測試技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羥基自由基的電化學分析方法。具體步驟有超疏水單分子自組裝膜的制備；光催化劑二氧化鈦(TiO2)膜的制備；·OH對超疏水單分子自組裝膜的降解；電化學交流阻抗法(ESI)表征超疏水單分子自組裝膜表面的電荷傳遞電阻(Rct)的變化；熒光光度法定量分析非接觸TiO2光催化產(chǎn)生的·OH；ESI間接分析檢測·OH六個步驟。本發(fā)明具有較高的選擇性和靈敏度，其線性范圍為1.8～43.8nmol，最低檢出限為1.8nmol，可以原位檢測細胞中產(chǎn)生的·OH，也可選擇性分析無機體系和生物體有機體系中的·OH。
文檔編號G01N21/64GK101929975SQ20101024556
公開日2010年12月29日 申請日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者劉巖, 朱安偉, 田陽 申請人:同濟大學