-單磷酸鈉相對含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種測定次黃苷與次黃苷-5' -單 磷酸鈉相對含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 次黃苷-5' -單磷酸鈉是酶化學(xué)法測定5' -核苷酸酶（5' -NT)的底物，以次黃 苷-5' -單磷酸鈉為主要原料之一的液體型5' -NT測定試劑具有穩(wěn)定、抗干擾能力好、能 實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析等特點(diǎn)，在臨床得以廣泛應(yīng)用。次黃苷-5' _單磷酸鈉在_20°C保存時(shí)具 有良好的穩(wěn)定性，受潮、受熱后易分解產(chǎn)生次黃苷，次黃苷-5'_單磷酸鈉中次黃苷與次黃 苷-5' -單磷酸鈉相對含量的高低顯著影響5' -NT測定試劑的靈敏度與空白吸光度值，是控 制5' -NT測定試劑批間差不可忽視的實(shí)驗(yàn)因素之一。
[0003] 目前實(shí)驗(yàn)室測定次黃苷_5'_單磷酸鈉樣品中次黃苷與次黃苷-5' -單磷酸鈉相對 含量時(shí)均采用高效液相色譜（HPLC)法，該法需要專用大型儀器，需要標(biāo)準(zhǔn)品做對照，檢測 費(fèi)時(shí)，檢測時(shí)還需要使用有毒溶劑甲醇，易造成環(huán)境污染。
[0004] 因此，尋求一種操作簡便、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的方法，對次黃苷_5' -單磷酸鈉樣 品中次黃苷與次黃苷-5' _單磷酸鈉相對含量進(jìn)行檢測就顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種測定次黃苷與次黃苷_5' _單磷酸鈉相對含 量的方法，利用由嘌呤核苷磷酸化酶（PNP)、黃嘌呤氧化酶（XTO)、過氧化物酶（POD)組成 的酶偶聯(lián)體系將次黃苷-5' _單磷酸鈉樣品中的次黃苷轉(zhuǎn)化為紫紅色醌衍生物并測定特定 波長下溶液吸光度值A(chǔ)1、加入含5' -核苷酸酶的緩沖液后繼續(xù)反應(yīng)一段時(shí)間后測定吸光度 值A(chǔ)2、利用A1值和A2值計(jì)算出黃苷-5' -單磷酸鈉底物中次黃苷與黃苷-5' -單磷酸鈉相對 含量。該法綠色、環(huán)保，無需校準(zhǔn)品對照即可計(jì)算出次黃苷與黃苷-5' -單磷酸鈉的相對含 量，并且用普通的可見分光光度計(jì)就可以實(shí)現(xiàn)檢測。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0007] -種測定次黃苷與次黃苷-5' -單磷酸鈉相對含量的方法，包括如下步驟：
[0008] 步驟 1、配制含有MgCl2、PNP、XTO、P0D、4-AAP、T00S、乙二醇、、蔗糖的pH7. 4-7. 8 磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀（K2HPO4-KH2PO4)緩沖液，得試劑A;
[0009] 步驟2、往步驟1所得的試劑A中加入含次黃苷和次黃苷-5' -單磷酸鈉的待測樣 品，在37°C環(huán)境中，反應(yīng)3. 5-5min，直至樣品中的次黃苷被轉(zhuǎn)化為紫紅色醌衍生物后，測定 540-560nm波長下的吸光度A1;
[0010] 步驟3、配制含5' -NT、乙二醇、蔗糖的pH7. 4-7. 8K2HP04-KH2P04緩沖液，得試劑B;
[0011] 步驟4、將步驟3所得的試劑B加入到步驟2所得溶液中，在37°C環(huán)境中，繼續(xù)反應(yīng) 5-10min，直至樣品中的次黃苷-5' -單磷酸鈉被轉(zhuǎn)化為紫紅色醌衍生物后，測定540-560nm 波長下的吸光度A2;
[0012] 步驟5、通過以下公式計(jì)算出次黃苷與次黃苷-5' -單磷酸鈉的相對含量：
[0013]樣品液中次黃苷/次黃苷_5' -單磷酸鈉（％) = (A1-Atl)X100%AA2-A1XV1Z^2)，
[0014] 式中，Atl為同體積的去離子水代替樣品與試劑A反應(yīng)所測得的吸光度值，A1為樣 品與試劑A反應(yīng)所測得的吸光度值，A2為樣品與試劑A反應(yīng)后繼續(xù)與試劑B反應(yīng)所測得的 吸光度值，％為樣品液和試劑A混合后的反應(yīng)體積，V2為樣品液與試劑A、試劑B混合后的 總反應(yīng)體積
[0015] 作為優(yōu)選，所述的步驟1中pH7. 4-7. 8K2HP04-KH2P04緩沖液中K2即04-腿#04濃度 為 10-30mmol/L、MgCl2濃度為 20-50mmol/L、PNP濃度為 2-20KU/L、XTO濃度為 5-30KU/L、 POD的濃度為 10-50KU/L、4-AAP的濃度為 0? 2-5mmol/L、T00S的濃度為 0? 5-10mmol/L、乙二 醇濃度為10-lOOml/L、蔗糖濃度為5-50g/L。
[0016] 作為優(yōu)選，所述的步驟3中pH7. 4-7. 8K2HP04-KH2P04緩沖液中K2即04-腿#04濃度 為 10-30mmol/L、5'-NT濃度為 20-200KU/L、乙二醇濃度為 10-lOOml/L、蔗糖濃度為 5-50g/ L0
[0017] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0018] 靈敏度高，線性、精密度好，結(jié)果準(zhǔn)確，且操作簡便快速，并可用于各種類型的分析 儀，達(dá)到大規(guī)模測定樣本的要求。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 精確稱取0. 1克左右樣品，用去離子水定容至樣品終濃度為0.lg/L的樣品液；配 制含有MgCl2 20mmol/L、PNP濃度為 2KU/L、XT0 濃度 5KU/L、P0D濃度為 10KU/L、4-AAP濃度 為0. 2mmol/L、T00S濃度為0. 5mmol/L、乙二醇濃度為10ml/L、鹿糖濃度為5g/L的10mmol/L pH7. 4K2HPO4-KH2PO4緩沖液為試劑A;配制含有5'-NT濃度為20KU/L、乙二醇濃度為IOml/ U蔗糖濃度為5g/L的lOmmol/LpH7. 4K2HPO4-KH2PO4緩沖液為試劑B。將試劑A和試劑 B用于測定樣品液時(shí)，采用的儀器為奧林巴斯2700全自動(dòng)生化分析儀，測定方法類型為終 點(diǎn)法，溫度為37°C，V樣品為3yI，300yI，V2為100y1，測定主/副波長為540/800nm， 試劑A加入樣本后在測定溫度反應(yīng)3. 5分鐘后讀取吸光度A1，繼續(xù)加入試劑B反應(yīng)5分鐘 后讀取吸光度A2。樣品液中次黃苷與次黃苷-5' -單磷酸鈉相對含量的計(jì)算公式為：樣品 液中次黃苷/次黃苷-5' -單磷酸鈉（％) = (A1-Atl)X100%AA2-A1XVyV2)，其中Atl為同 體積的去離子水代替樣品與試劑A反應(yīng)所測得的吸光度值，A1為樣品與試劑A反應(yīng)所測得 的吸光度值，A2為樣品與試劑A反應(yīng)后繼續(xù)與試劑B反應(yīng)所測得的吸光度值，V:為樣品液 和試劑A混合后的反應(yīng)體積，V2S樣品液和試劑A、試劑B混合后的總反應(yīng)體積。用本法和 HPLC法同時(shí)測定了 11例樣品液中次黃苷與次黃苷-5' -單磷酸鈉相對含量。
[0022] 表1為本實(shí)施例所述方法測定的結(jié)果與HPLC法測定測定結(jié)果對照表。
[0023]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測定次黃苷與次黃苷-5' -單磷酸鈉相對含量的方法，其特征在于，包括如下步 驟： 步驟 1、配制含有MgCl2、PNP、XTO、P0D、4-AAP、TOOS、乙二醇、、蔗糖的pH7. 4-7. 8 磷酸 氫二鉀-磷酸二氫鉀（K2HPO4-KH2PO4)緩沖液，得試劑A; 步驟2、往步驟1所得的試劑A中加入含次黃苷和次黃苷-5' -單磷酸鈉的待測樣品， 在37°C環(huán)境中，反應(yīng)3. 5-5min，直至樣品中的次黃苷被轉(zhuǎn)化為紫紅色醌衍生物后，測定 540-560nm波長下的吸光度A1; 步驟3、配制含5' -NT、乙二醇、蔗糖的pH7. 4-7. 8K2HP04-KH2P04緩沖液，得試劑B; 步驟4、將步驟3所得的試劑B加入到步驟2所得溶液中，在37°C環(huán)境中，繼續(xù)反應(yīng) 5-10min，直至樣品中的次黃苷-5' -單磷酸鈉被轉(zhuǎn)化為紫紅色醌衍生物后，測定540-560nm 波長下的吸光度A2; 步驟5、通過以下公式計(jì)算出次黃苷與次黃苷-5' -單磷酸鈉的相對含量： 樣品液中次黃苷/次黃苷-5' _單磷酸鈉（％) = (A1-Atl)X100%AA2-A1XV1A2)， 式中，Atl為同體積的去離子水代替樣品與試劑A反應(yīng)所測得的吸光度值，A1S樣品與 試劑A反應(yīng)所測得的吸光度值，A2為樣品與試劑A反應(yīng)后繼續(xù)與試劑B反應(yīng)所測得的吸光 度值，％為樣品液和試劑A混合后的反應(yīng)體積，V2為樣品液與試劑A、試劑B混合后的總反 應(yīng)體積。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定次黃苷與次黃苷-5' -單磷酸鈉相對含量的方法， 其特征在于，所述的步驟1中pH7. 4-7. 8K2HP04-KH2P04緩沖液中K2HP04-KH2P04濃度為 10-30mmol/L、MgCl2濃度為 20-50mmol/L、PNP濃度為 2-20KU/L、XTO濃度為 5-30KU/L、POD 的濃度為 10-50KU/L、4-AAP的濃度為 0. 2-5mmol/L、TOOS的濃度為 0. 5-10mmol/L、乙二醇 濃度為l〇-l〇〇ml/L、蔗糖濃度為5-50g/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定次黃苷與次黃苷-5' -單磷酸鈉相對含量的方法， 其特征在于，所述的步驟3中pH7. 4-7. 8K2HP04-KH2P04緩沖液中K2HP04-KH2P04濃度為 10-30mmol/L、5'-NT濃度為 20-200KU/L、乙二醇濃度為 10-lOOml/L、蔗糖濃度為 5-50g/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定次黃苷與次黃苷-5'-單磷酸鈉相對含量的方法，利用由嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶組成的酶偶聯(lián)體系將次黃苷-5'-單磷酸鈉樣品中的次黃苷轉(zhuǎn)化為紫紅色醌衍生物并測定特定波長下溶液吸光度值A(chǔ)1、加入含5'-核苷酸酶的緩沖液后繼續(xù)反應(yīng)一段時(shí)間后測定吸光度值A(chǔ)2、利用A1值和A2值計(jì)算出黃苷-5'-單磷酸鈉底物中次黃苷與黃苷-5'-單磷酸鈉相對含量，綠色、環(huán)保，無需校準(zhǔn)品對照即可計(jì)算出次黃苷與黃苷-5'-單磷酸鈉的相對含量，并且用普通的可見分光光度計(jì)就可以實(shí)現(xiàn)檢測，靈敏度高，線性、精密度好，結(jié)果準(zhǔn)確，且操作簡便快速，并可用于各種類型的分析儀，達(dá)到大規(guī)模測定樣本的要求。
【IPC分類】G01N21-31
【公開號】CN104764703
【申請?zhí)枴緾N201510185429
【發(fā)明人】潘利琴
【申請人】溫州市人民醫(yī)院
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月18日