吡咯并三嗪類衍生物在預(yù)防或治療乙肝病毒感染中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及化咯并=嗦類衍生物在預(yù)防或治療乙肝病毒感染中的應(yīng)用，屬于制藥 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎化B)是由乙型肝炎病毒化BV)引起的并具有高傳染性的世界性疾病。乙 肝病毒由核屯、和包圍核屯、的外殼兩個(gè)部分組成。內(nèi)部的核屯、部分包括了雙鏈脫氧核糖核酸 (DNA)和DNA聚合酶(病毒復(fù)制所需的酶）。而外部的外殼則由S種蛋白組成，分別命名為L(zhǎng)蛋 白、M蛋白和S蛋白。病毒的復(fù)制是在受感染的肝細(xì)胞內(nèi)完成，首先病毒進(jìn)入肝細(xì)胞后，脫去 衣殼，病毒DNA進(jìn)入肝細(xì)胞核并在DNA聚合酶的作用下復(fù)制DNA，然后含有雙鏈DNA的內(nèi)殼裹 上外殼，成為病毒體，最后從肝細(xì)胞漿釋放至肝細(xì)胞外。病毒的外殼蛋白即乙肝表面抗原由 于過(guò)量產(chǎn)生W及不斷的釋放入血，因此可通過(guò)檢測(cè)測(cè)試者血清中的表面抗原含量作為一種 判斷是否感染的免疫學(xué)方法。
[0003] 乙肝病毒的傳播途徑多種多樣，包括食物、體液傳播、接觸性傳播、醫(yī)源性傳播、胎 源性傳播等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約有10%的急性乙肝患者會(huì)轉(zhuǎn)變成慢性肝炎。全世界大約有20億的 乙肝感染者，其中有3億5千萬(wàn)為慢性肝炎患者并可能轉(zhuǎn)變成肝硬化和肝細(xì)胞癌。
[0004] 目前治療乙肝的方法就是注射a干擾素和給入核巧類聚合酶抑制劑，例如恩替卡 韋和阿德福韋，W及非核巧類聚合酶抑制劑(順TI),例如拉米夫定。從目前的治療效果看， 運(yùn)些治療方法治療周期長(zhǎng)、副作用大且會(huì)出現(xiàn)耐藥性，因此迫切需要研制可針對(duì)病毒周期 不同階段的新的更好的制劑或方法。
[0005] 其中，一種可行的方法就是抑制病毒進(jìn)入肝細(xì)胞。研究表明，外殼L蛋白的前S蛋白 區(qū)為感染的關(guān)鍵部位?；谶\(yùn)一發(fā)現(xiàn)和此處蛋白的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)研發(fā)了全新的多膚類藥物， Myrcludex B。在體外實(shí)驗(yàn)中，用運(yùn)種多膚藥物預(yù)處理后可有效防止病毒進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)一步 表明在病毒進(jìn)入細(xì)胞的最初階段，病毒外殼蛋白的運(yùn)一區(qū)域可與肝細(xì)胞的特定部位發(fā)生作 用。還有研究表明，免疫抑制劑環(huán)抱素 A會(huì)通過(guò)各種機(jī)制抑制乙肝病毒的活性，其中一種可 能的機(jī)制為阻斷鋼離子/牛橫膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NTCP)的轉(zhuǎn)運(yùn)，而NTCP是將膽酸從血液中轉(zhuǎn) 運(yùn)進(jìn)入肝細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)體。
[0006] 轉(zhuǎn)運(yùn)體是決定大多數(shù)藥物和內(nèi)源性物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和分布的關(guān)鍵性膜蛋白。鋼離子/牛 橫膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NTCP)就是膽酸鹽的肝腸循環(huán)中的關(guān)鍵性膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體。NTCP蛋白由 335個(gè)氨基酸組成，具有9個(gè)跨膜多膚鏈，屬于膜蛋白中可溶性物質(zhì)載體(SLC)超家族。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)技術(shù)現(xiàn)狀提供一種化咯并=嗦類衍生物在預(yù) 防或治療乙肝病毒感染中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:一種化咯并=嗦類衍生物在預(yù)防 或治療乙肝病毒感染中的應(yīng)用，所述化咯并=嗦類衍生物的結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0010] 式I中，Ri的結(jié)構(gòu)如式II或式HI所示：
[001引式^和式III中，R3、R4分別選自F、Cl、Br、I、硝基、橫酸基、徑基、簇基、氨基、甲氧 基、酷胺基或氯基；
[001引式忡，R2的選自如下基團(tuán)：
[001引其中，Rs、R6分別為燒控基、締控基、烘控基、甲氧基或甲氨基，X為大于等于零且小 于等于5的整數(shù)，y為大于等于零且小于等于4的整數(shù)。
[0016] 擁有上述結(jié)構(gòu)的化咯并S嗦類衍生物可充當(dāng)NTCP抑制劑，運(yùn)些衍生物既是IGF-IR 激酶抑制劑，也是NTCP轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制劑從而可阻斷牛膽橫酸進(jìn)入肝細(xì)胞。運(yùn)類NTCP抑制劑 可阻斷NTCP的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，因此可用于預(yù)防乙肝疾病、肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生。
[0017] 其中，所述化咯并=嗦類衍生物的結(jié)構(gòu)如式IV所示：
[0020] 上述結(jié)構(gòu)的化合物為BMS-754807,結(jié)構(gòu)為（S)-1-[4-[(5-環(huán)丙基-IH-化挫-3-基） 氨基M咯并[2，1-F][1，2,4]S嗦-2-基]-N-(6-氣-3-化晚基)-2-甲基化咯燒-2-甲酯胺。 其能更有效地阻斷牛膽橫酸進(jìn)入肝細(xì)胞。
[0021] 其中，所述化咯并=嗦類衍生物與其他能預(yù)防和/或治療乙肝病毒感染的藥物配 合，形成藥物組合物，所述藥物組合物用于預(yù)防和/或治療乙肝病毒感染。
[0022] 因上述結(jié)構(gòu)的化咯并=嗦類衍生物能預(yù)防哺乳類動(dòng)物感染乙肝病毒，所W，上述 的給藥方案包含了一種或多種具有類似BMS-754807結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的并有治療效果的化合物，其 治療效果更佳。
[0023] 其中，所述其他能預(yù)防和/或治療乙肝病毒感染的藥物為干擾素 a、乙肝病毒的閉 合環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑、CCC DNA生物合成抑制劑、天然抑制劑W及乙肝病毒外殼組裝抑制 劑中的一種或兩種的組合。
[0024] 其中，所述天然抑制劑為木蘭醇和/或青葉膽提取物。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：化咯并S嗦類衍生物可通過(guò)抑制NTCP轉(zhuǎn)運(yùn) 體活性來(lái)抑制牛膽橫酸進(jìn)入肝細(xì)胞，因此運(yùn)些化合物也可用于抑制乙肝病毒進(jìn)入肝細(xì)胞， 從而預(yù)防病毒感染和乙肝疾病的發(fā)生。本化咯并=嗦類衍生物可用于預(yù)防在乙肝早期階段 時(shí)接觸病毒的人群感染乙肝W及治療早后期的乙肝疾病。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例BMS-754807對(duì)批次為FY015的人肝細(xì)胞NTCP抑制的抑制曲線；
[0027] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例BMS-754807對(duì)批次為ZS006的人肝細(xì)胞NTCP抑制的抑制曲線； [002引圖3為本發(fā)明實(shí)施例BMS-754807對(duì)批次為FY016的人肝細(xì)胞NTCP抑制的抑制曲線；
[0029] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例BMS-754807在hNTCP-293細(xì)胞上攝取的Km和Vmax;
[0030] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例BMS-754807對(duì)人NTCP-293抑制的抑制曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0031] W下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0032] 本實(shí)施例建立了一種抗乙肝病毒的藥物的鑒定方法，為的是考察運(yùn)些藥物是否通 過(guò)祀向作用于病毒和牛膽橫酸進(jìn)入肝細(xì)胞的通道。進(jìn)而為了通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)測(cè)試化合物抑制 牛膽橫酸進(jìn)入肝細(xì)胞的能力來(lái)鑒定和研發(fā)可阻斷乙肝病毒進(jìn)入細(xì)胞的且口服有效的藥物。 該體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ晚毮鼙磉_(dá)正常生理水平的NTCP轉(zhuǎn)運(yùn)體，并包含無(wú)抑制劑組和有抑制劑組從 而比較抑制劑對(duì)牛膽橫酸肝攝取的影響。
[0033] 本實(shí)施例又提供了一種評(píng)估在特定培養(yǎng)條件下肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的方法。該方法 是W新鮮或凍存的人、大鼠、黑猩猩或者樹(shù)駒的肝細(xì)胞為模型，采用攝取實(shí)驗(yàn)研究待測(cè)化合 物對(duì)牛膽橫酸的肝攝取的影響，并可計(jì)算有抑制效果的化合物的半數(shù)抑制濃度(I巧0)。
[0034] 本實(shí)施例還提供了一種化合物的隨機(jī)篩選或者對(duì)化合物進(jìn)行有選擇性的結(jié)構(gòu)分 析的方法。此方法是通過(guò)W懸浮或貼壁肝細(xì)胞為模型，測(cè)試化合物對(duì)肝攝取的抑制能力來(lái) 篩選可抑制NTCP活性的化合物。而對(duì)潛在抑制劑的結(jié)構(gòu)分析可篩選一組類藥化合物來(lái)進(jìn)行 懸浮或貼壁細(xì)胞對(duì)牛膽橫酸肝攝取的抑制實(shí)驗(yàn)，運(yùn)樣有利于提高篩選效率和總結(jié)規(guī)律。
[0035] 本實(shí)施例設(shè)及一種化咯并=嗦類衍生物在預(yù)防或治療乙肝病毒感染中的應(yīng)用，本 實(shí)施例具體采用的化咯并S嗦類衍生物為BMS-754807，CAS號(hào)為1001350-96-4,化學(xué)名為 (S)-1-[4-[(5-環(huán)丙基-IH-化挫-3-基)氨基]郵咯并[2，l-F][l，2,4]S嗦-2-基]-N-(6-氣-3-化晚基)-2-甲基化咯燒-2-甲酯胺，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0037] 下面逐步對(duì)BMS-754807的性能進(jìn)行分析。
[003引 一、BMS-754807對(duì)NTCP轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制作用
[0039] 1、W大鼠肝細(xì)胞為模型，研究BMS-754807對(duì)大鼠 NTCP的抑制作用。
[0040] 肝攝取抑制實(shí)驗(yàn)的方法具體為:采用新鮮制備的雄性Sprague-Dawl巧大鼠肝細(xì)胞 為研究載體，W濃度范圍為100到0.化M的化合物BMS-754807作用于懸浮的或者貼壁的大鼠 肝細(xì)胞，WNTCP特異性底物気代的牛膽橫酸鋼為檢測(cè)指標(biāo)，研究化合物BMS-754807對(duì)肝攝 取的抑制。結(jié)果顯示該化合物在此濃度范圍內(nèi)可不同程度的抑制牛膽橫酸進(jìn)入肝細(xì)胞。W BMS-754807的作用濃度和對(duì)應(yīng)的抑制率做曲線，從而計(jì)算出對(duì)懸浮和貼壁細(xì)胞的半數(shù)抑制 濃度（I巧0)分別為51.1和1.9iiM。
[0041 ] 2、W人肝細(xì)胞為模型，研究BMS-754807對(duì)人NTCP的抑制作用。
[0042]方法同大鼠肝細(xì)胞模型方法，W新鮮制備的人肝細(xì)胞通過(guò)=明治培養(yǎng)24h后，加入 濃度范圍為100到0.1 yM的化合