本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種細(xì)菌菌株，微生物菌劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：我國(guó)作物秸稈資源豐富，數(shù)量巨大，種類多樣，每年的作物秸稈產(chǎn)出量7～8億噸。由于秸稈在短期內(nèi)不易腐解，利用效率低，絕大部分秸稈廢棄或被焚燒，在種植業(yè)為主的地區(qū)，作物秸稈已經(jīng)成為生產(chǎn)中的障礙。所以，焚燒秸稈遍及廣大鄉(xiāng)村，由此引起環(huán)境污染與有機(jī)資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國(guó)用作還田和有機(jī)肥料的作物秸稈僅占總量的20％左右，焚燒占17％，尚有50％未被利用。我國(guó)北方地區(qū)的諸多省份都是農(nóng)業(yè)大省，對(duì)秸稈處理的需求更為迫切。北方地區(qū)秋冬季節(jié)氣候冷涼，不利于玉米秸稈木質(zhì)素、纖維素的降解。所以突破北方地區(qū)不良?xì)夂虻臈l件下，秸稈大規(guī)模、快速腐熟還田技術(shù)瓶頸是實(shí)現(xiàn)我國(guó)北方地區(qū)秸稈利用亟待解決的問(wèn)題。選育和利用作物秸稈高效耐低溫的降解微生物菌株，研發(fā)高效降解菌劑，建立作物秸稈田間原位生物轉(zhuǎn)化還田技術(shù)，是解決我國(guó)北方秸稈降解問(wèn)題的重要發(fā)展趨勢(shì)之一。利用秸稈降解微生物進(jìn)行玉米、小麥、水稻秸稈的降解與原位還田具有巨大的應(yīng)用潛力。復(fù)合菌系的篩選研究也有一些報(bào)道，有關(guān)秸稈發(fā)酵菌劑的產(chǎn)品非常少，尚未形成體系，更沒有穩(wěn)定高效秸稈快速降解菌群的生產(chǎn)使用。秸稈快速腐解技術(shù)尚未得到有效地解決，限制了秸稈資源的高效利用。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一方面目的在于提供具有纖維素降解功能的細(xì)菌菌株，該菌株耐低溫能力強(qiáng)，且具有非常好的纖維素降解功能。本發(fā)明的另一目的在于提供包含如上所述細(xì)菌菌株的微生物菌劑，該混合菌劑分解纖維素的能力明顯強(qiáng)于其中任何一個(gè)單一菌株，可很好地應(yīng)用于秸稈降解之中。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：根據(jù)本發(fā)明的一方面，涉及一種細(xì)菌菌株，所述菌株為彎曲芽孢桿菌d3，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：cgmccno.14091；保藏時(shí)間為：2017年5月4日。該菌種的拉丁學(xué)名為bacillusflexus，中文學(xué)名為香草芽孢桿菌，菌株名為d3。該菌株具有高效的秸稈降解功能，且對(duì)低溫耐受性較強(qiáng)。上述的經(jīng)過(guò)分離純化的彎曲芽孢桿菌，其菌落為圓形、扁平、灰白色、不透明、黏稠、大小中等、表面不光滑、邊緣不規(guī)則。含有所述彎曲芽孢桿菌d3的微生物菌劑也屬于本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍。對(duì)于該菌株而言，考慮到應(yīng)用時(shí)的秸稈降解效率及其可能需要運(yùn)輸?shù)仍?，有必要將其擴(kuò)大培養(yǎng)制成微生物菌劑的形式以擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。優(yōu)選的，上述微生物菌劑還包括以下菌株中的一種、兩種或全部：彎曲芽孢桿菌a1，保藏編號(hào)為cgmccno.14088；蘇云金芽孢桿菌a2，保藏編號(hào)為cgmccno.14089；以及香草芽孢桿菌b2，保藏編號(hào)為cgmccno.14090；上述噬菌體均保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏時(shí)間為：2017年5月4日。在一些實(shí)施方式中，所述微生物菌劑中含有所述彎曲芽孢桿菌d3及所述彎曲芽孢桿菌a1；在一些實(shí)施方式中，所述微生物菌劑中含有所述彎曲芽孢桿菌d3及所述蘇云金芽孢桿菌a2；在一些實(shí)施方式中，所述微生物菌劑中含有所述彎曲芽孢桿菌d3及所述香草芽孢桿菌b2；在一些實(shí)施方式中，所述微生物菌劑中含有所述彎曲芽孢桿菌d3、所述彎曲芽孢桿菌a1及所述蘇云金芽孢桿菌a2；在一些實(shí)施方式中，所述微生物菌劑中含有所述彎曲芽孢桿菌d3、所述彎曲芽孢桿菌a1及所述香草芽孢桿菌b2；在一些實(shí)施方式中，所述微生物菌劑中含有所述彎曲芽孢桿菌d3、所述蘇云金芽孢桿菌a2及所述香草芽孢桿菌b2；優(yōu)選的，如上所述的微生物菌劑，以活菌數(shù)計(jì)，所述菌劑中彎曲芽孢桿菌a1、蘇云金芽孢桿菌a2、香草芽孢桿菌b2以及彎曲芽孢桿菌d3的混合比例為(1～5):(1～5):(1～5)：(1～5)。更優(yōu)選的，所述菌劑中彎曲芽孢桿菌a1、蘇云金芽孢桿菌a2、香草芽孢桿菌b2以及彎曲芽孢桿菌d3等比混合。上述的微生物菌菌劑，優(yōu)選為液體菌劑，該液體菌劑中，培養(yǎng)液可優(yōu)選為液體培養(yǎng)基，例如lb液體培養(yǎng)基，或者進(jìn)一步添加葡萄糖、硫胺素、生物素和煙酸等營(yíng)養(yǎng)物。優(yōu)選的，為了實(shí)現(xiàn)良好的纖維素降解效果，在該液體菌劑中，每種菌株的活菌的數(shù)量≥1×107cfu/ml，優(yōu)選的，每種菌株的活菌的數(shù)量是1×107-16cfu/ml；更優(yōu)選為1×108-15cfu/ml，也可以選擇1×109cfu/ml，1×1010cfu/ml，1×1011cfu/ml，1×1012cfu/ml，1×1013cfu/ml，1×1014cfu/ml等。優(yōu)選的，如上所述的微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟：本發(fā)明基于上述的液體微生物菌劑提供了一種制備方法，包括如下步驟：將如上所述的菌株接種于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到液體菌劑；可選的，將所述液體菌劑過(guò)濾和/或濃縮。整個(gè)微生物菌劑的制備方法簡(jiǎn)單，可以短時(shí)間保存和方便運(yùn)輸，使用的時(shí)候直接以一定的比例添加到土壤中即可，使用非常方便。上述的微生物菌菌劑，優(yōu)選為固體菌劑，所述固體菌劑由如上所述的菌株附加固態(tài)載體和/或助劑制備而成。優(yōu)選的，如上所述的微生物菌劑，所述固態(tài)載體包括草炭、糠粉、麥麩、高嶺土、輕質(zhì)碳酸鈣、硅藻土、白炭黑、滑石粉、細(xì)沙以及粘土中的一種或多種。優(yōu)選的，如上所述的微生物菌劑，所述助劑選自蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、豆粕、十二烷基苯磺酸鈉、烷基萘磺酸鈉縮聚物中的一種或兩種以上的混合物。本發(fā)明基于上述的固體微生物菌劑提供了一種制備方法，包括如下步驟：將經(jīng)過(guò)純化后得到的所述菌株混于固態(tài)載體和/或助劑中既得。如上所述的菌株、或如上所述的菌劑在秸稈消納中的應(yīng)用。該菌劑可用于玉米、小麥、水稻秸稈的降解與原位還田。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供一種高效降解秸稈的微生物菌株，以及包含該菌株的微生物菌劑，該菌劑的主要成分四種微生物菌株構(gòu)成，尤其適合北方玉米秸稈的快速降解，在作物秸稈田間原位還田中具有重要作用。同時(shí)，具有能夠增加土壤腐殖質(zhì)、提高土壤肥力的作用。本發(fā)明提供的彎曲芽孢桿菌(bacillusflexus)，菌株名為a1，保藏編號(hào)cgmccno.14088；本發(fā)明提供的蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringensis)，菌株名為a2，保藏編號(hào)cgmccno.14089；本發(fā)明提供的香草芽孢桿菌(bacillusvanillea)，菌株名為b2，保藏編號(hào)cgmccno.14090；本發(fā)明提供的彎曲芽孢桿菌(bacillusflexus)，菌株名為d3，保藏編號(hào)cgmccno.14091；上述菌株均保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏時(shí)間均為：2017年5月4日。經(jīng)保藏中心于2017年5月4日檢測(cè)為存活菌株。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1本實(shí)施例提供了個(gè)微生物菌株的篩選方法及菌劑的組合方法。1、實(shí)驗(yàn)材料1.1菌株與土壤供試菌株：菌種庫(kù)保藏纖維素降解細(xì)菌。東北黑土：吉林公主嶺田間0～20cm表土。1.2培養(yǎng)基1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，瓊脂16～18g，去離子水1l。1.2.2細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基(ypd全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基)：溶解酵母膏/酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l于1l去離子水中，ph7.0。1.2.3纖維素降解菌培養(yǎng)基：kh2po40.5g、mgso40.25g、蛋白胨2g、羧甲基纖維素鈉(cmc)1.88g、剛果紅0.2g、瓊脂16～18g，去離子水1l，ph7.0。1.2.4基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液(赫奇遜氏培養(yǎng)基)：磷酸二氫鉀1.0g，nacl0.1g，nano32.5g，去離子水1l，ph自然。單菌株低溫活性篩選方法2.1菌株活化與復(fù)壯接種環(huán)挑取保藏斜面管內(nèi)的菌落接種于不加瓊脂的細(xì)菌液體培養(yǎng)基(1.2.1)內(nèi)，在28℃溫度下培養(yǎng)72h，制備單菌株供試菌液。2.2菌株低溫活性篩選250ml三角搖瓶?jī)?nèi)加入40克土壤，噴水潤(rùn)濕潤(rùn)至含水量為30～50％田間持水率，透氣膜封口濕熱滅菌3～5次，用細(xì)菌培養(yǎng)基(1.2.1)平板檢驗(yàn)土壤無(wú)活菌后，接種2ml供試菌液，28℃培育3天，然后以-20℃保溫24h；20℃保溫24h為一個(gè)循環(huán)。凍融循環(huán)9次后，在搖瓶?jī)?nèi)加入100ml無(wú)菌水，往復(fù)震蕩(轉(zhuǎn)速170r/min)30分鐘制備土壤懸液，逐級(jí)稀釋，平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)測(cè)定。當(dāng)凍融循環(huán)后土壤中菌體數(shù)量>1011cfu/g土?xí)r，所接種的菌株判定為低溫高活性。表1接種菌株凍融循環(huán)9次后計(jì)數(shù)(cfu/g.土)a11.38×1012a22.72×1011b19.50×1012b21.16×1012d16.50×1012d25.60×1016d31.26×10122.3搖瓶法篩選高效秸稈降解菌株于100ml三角瓶中，加入50ml基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液(1.2.4)和5g烘干玉米碎秸稈，濕熱法滅菌后，接種表1高活性低溫菌株，在30℃、170r/min振蕩培養(yǎng)10天、15天和20天，每個(gè)處理重復(fù)三次，同時(shí)做基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液+秸稈對(duì)照ck，測(cè)定培養(yǎng)10天、15天和20天秸稈失重率，接種菌株處理秸稈的減重率比不接種菌空白對(duì)照秸稈減重率相對(duì)提高10％以上分別為降解功能強(qiáng)的菌株。表2表3根據(jù)表2和表3，接種10天降解效果好的菌株有a1、a2、b1和b2，接種15天秸稈降解功能強(qiáng)的菌株有b1、b2、d1、d2和d3，接種20天的高效秸稈降解菌株包括a1、a2、b2和d3。2.4復(fù)合菌系篩選設(shè)置a1a2-b-d型4株菌組合即除去2株菌之后任意b1或b2菌與d1、d2或d3的組合。將各菌株組合的菌懸液按照體積比1∶1混合，分別接種6ml于混合有5克烘干秸稈的滅菌蛭石內(nèi)，保持蛭石飽和吸水狀態(tài)，在人工氣候室培養(yǎng)20天(25℃日、20℃夜)；測(cè)定20d時(shí)秸稈失重率，每個(gè)重復(fù)3次，同時(shí)做基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液+秸稈對(duì)照ck。接種菌劑秸稈失重率與相對(duì)空白提高百分率為促腐率，促腐率大于10％者為所篩選的復(fù)合菌系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到a1a2b3d3、a1a2b2d3、a1a2b2d1、a1a2b2d5、a1a2b2d4等5組復(fù)合菌系。其中，a1即對(duì)應(yīng)本發(fā)明保藏的彎曲芽孢桿菌a1；a2對(duì)應(yīng)本發(fā)明保藏的蘇云金芽孢桿菌a2；b2對(duì)應(yīng)本發(fā)明保藏的香草芽孢桿菌b2；d3對(duì)應(yīng)本發(fā)明保藏的彎曲芽孢桿菌d3；表4實(shí)施例2本實(shí)施例提供了一種液體菌劑及其制備方法，具體包括以下步驟：在細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基中(1.2.2)制備單株菌液，糠麩粉按固液比1：2比例吸附單菌液，制備單菌劑a1、a2、b2、d3；4種單菌劑等比例混合、風(fēng)干裝袋，完成復(fù)合菌劑的制備。測(cè)得所得液體菌劑中為各菌株的含量均為1×1010-11cfu/ml。實(shí)施例3在本實(shí)施例中，制備操作同實(shí)施例1，與實(shí)施例1不同的是，在本實(shí)施例中，制備單菌劑a1、b2、d3；3種單菌劑按照活菌數(shù)1:3:5的比例混合、風(fēng)干裝袋，完成復(fù)合菌劑的制備。實(shí)施例4本實(shí)施例提供了一種固體菌劑及其制備方法，具體包括以下步驟：將上述實(shí)施例2制成的液體菌劑按照每1千克液體菌劑配30克滑石粉(作為固體載體)的比例加入至滑石粉中充分?jǐn)嚢杌靹?，過(guò)濾、干燥、粉碎，即得固體菌劑。實(shí)施例5本實(shí)施例中，制備操作同實(shí)施例4，與實(shí)施例4不同的是，在本實(shí)施例中，所用的固體載體為滑石粉、細(xì)沙以及粘土等比例的混合物。實(shí)驗(yàn)例田間效果驗(yàn)證玉米10月收獲后粉碎，在秸稈表面均勻施撒5公斤實(shí)施例2制備得到的復(fù)合菌劑，深翻30公分把秸稈埋入土中，同時(shí)埋入秸稈樣袋，第二年春天開始測(cè)定秸稈樣品腐解率(以減重率計(jì)算)。表5表6表7由表6和表7結(jié)果看出，在公主嶺和雙城春季玉米苗期和大喇叭口期(5月～7月)生長(zhǎng)階段，本發(fā)明提供的復(fù)合菌劑在田間對(duì)翻埋秸稈有很好的促腐效果。盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。當(dāng)前第1頁(yè)12