重組生物體3 - 羥基丙酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種重組生物體3 -羥基丙酸的制備方法。_2] 發(fā)明背景
基因工程技術(shù)，允許轉(zhuǎn)移的物種和許可證之間的遺傳性狀，特別是從一個(gè)物種轉(zhuǎn)移酶給他人。這些技術(shù)已達(dá)到商業(yè)化的具有高附加值的產(chǎn)品，如藥品。的基因工程技術(shù)中是同樣適用的和成本有效的時(shí)，適用于基因和酶可用于進(jìn)行基本的化工原料。
[0003]還存在于細(xì)菌肺炎克雷伯菌，它有能力從甘油生物生產(chǎn)3 -羥基丙甲代謝途徑。原生微生物的能力，從甘油生產(chǎn)1，3 -丙二醇，以及。商業(yè)利益正在探索生產(chǎn)1，3 -丙二醇，甘油或葡萄糖，重組已設(shè)計(jì)，以表達(dá)必要的酶，用于生產(chǎn)1，3 -丙二醇從其他生物的生物體。
[0004]3 -羥基丙酸是一個(gè)3個(gè)碳原子的有機(jī)分子。這種分子的IUPAC命名的名稱是3-輕基丙酸。它也被稱為3 -輕基丙酸甲酯。beta, hydroxprop1nic的酸,beta.-輕基丙酸甲酯，3 -輕基丙酸,3 -輕基丙,輕基丙酸,乳酸乙烯,beta.-乳酸和2 deoxyglceric酸。3-HP中的應(yīng)用包括制造可吸收的假體裝置和外科手術(shù)縫合線，β -內(nèi)酰胺的摻入，制備丙烯酸，形成的trifluromethylated醇或二醇，的polyhydroxyalkonates,和乳酸的共聚物，具有。3-HP現(xiàn)在普遍用于商業(yè)用途所產(chǎn)生的有機(jī)化工合成。3-HP的生產(chǎn)及銷售的這些方法相對(duì)昂貴，并且將使用它的單體的聚合物的制造生產(chǎn)成本高昂。正如下面所討論的，一些生物是已知的生產(chǎn)3_HP。然而，尚未提供一個(gè)目錄，從這些生物體的基因，從而合成3-HP使用的酶本身負(fù)責(zé)的本機(jī)主機(jī)產(chǎn)生它不存在于該分子的合成能力。
[0005]3-HP在除了其商業(yè)實(shí)用程序，它被發(fā)現(xiàn)在許多生物過(guò)程，包括許多天然存在的生物聚合物。聚(3 -羥基丁酸酯)(PHB)的微生物的聚酯，含有羥基的單體稱為polyhydroxyalkonates 酯(PHAs)是最豐富的部件。
[0006]PHA的含有3-HP發(fā)表的研究大部分集中在兩個(gè)細(xì)菌來(lái)源:青枯雷爾氏桿菌(“產(chǎn)堿eutrophus”)和假單胞菌oleovorans的。氧產(chǎn)堿桿菌和假單胞菌oleovorans能夠生長(zhǎng)在無(wú)氮培養(yǎng)基中的3 -羥基丙酸，1，5 -戊二醇或1，7 -庚二醇。當(dāng)3-HP是主要的羥基酸，聚(3 -羥基丁酸酯-共-3 -羥基丙酸)加入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有7% (摩爾)3 -羥基丙酸的形成。這些細(xì)胞也存儲(chǔ)的3%，3 -羥基丙酸的聚(3 - 丁酸酯-共-3 -羥基丙酸)。
[0007]重組系統(tǒng)已被用于創(chuàng)建PHA的。氧產(chǎn)堿桿菌無(wú)論從設(shè)計(jì)，以表達(dá)PHA合成酶的大腸桿菌菌株生產(chǎn)聚(3 -羥基丙酸)當(dāng)喂1，3 -丙二醇。在細(xì)菌的途徑，甘油轉(zhuǎn)化為1，3 -丙二醇，甘油脫水酶，催化轉(zhuǎn)化甘油3 -羥基丙醛和水。這種酶已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在一個(gè)包括檸檬酸桿菌屬，克雷伯氏菌屬，乳桿菌屬，梭狀芽孢桿菌菌株的細(xì)菌數(shù)。在1，3 -丙二醇的通路的第二酶1，3 -丙二醇氧化還原酶(EC 1.1.202)降低1，3 -丙二醇中的NADH依賴性反應(yīng)。甘油，1，3 -丙二醇的轉(zhuǎn)化率的途徑已在大腸桿菌中表達(dá)。Tong等，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)57 (12) 3541-3546。用于生產(chǎn)1，3 -丙二醇的基因進(jìn)行了克隆從肺炎克雷伯菌的DHA的調(diào)節(jié)子。甘油甘油促進(jìn)被運(yùn)送到細(xì)胞中，和然后由一個(gè)輔酶依賴B.sub.12的脫水轉(zhuǎn)化成3 -羥基丙醛。大腸桿菌缺乏一個(gè)土生土長(zhǎng)的調(diào)節(jié)因子，因此大腸桿菌不能有氧增長(zhǎng)甘油沒(méi)有外源電子受體，如硝酸鹽或富馬酸。
[0008]醛脫氫酶的酶催化的醛氧化成羧酸。在各種各樣的生物體，例如，非特異性醛脫氫酶的編碼基因已被確定，ALDH2從智人，ALD4從釀酒酵母，和來(lái)自大腸桿菌的ALDA aldB。分類的這些酶的輔因子的使用，需要要么AND.sup。+或NADP.sup的。+和一些將使用任一輔因子。挑出在這里提及的基因能夠作用于若干不同的醛，很可能，它們可以是能夠氧化3 -
羥基丙醛，3 -羥基丙酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是，允許創(chuàng)建的重組微生物宿主，其能夠從甘油或葡萄糖為起始原料合成3-HP。甘油或葡萄糖轉(zhuǎn)化，然后轉(zhuǎn)換為3-HP。此過(guò)程需要所謂的DHAB從肺炎克雷伯菌的基因，其編碼的酶甘油脫水四個(gè)不同的醛脫氫酶基因中的任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)換3-HPA 3-HP。四醛脫氫酶基因從細(xì)菌大腸桿菌，ALDH2的人類，從釀酒酵母，大腸桿菌aldB ALD4阿爾達(dá)。酵母基因出現(xiàn)，以得到最佳的效果。
[0010]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種編碼甘油脫水酶和所需的3 -羥基丙酸的生產(chǎn)從甘油醛脫氫酶的基因構(gòu)建。
[0011]這也是本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種方法，用于從甘油生產(chǎn)3 -羥基丙酸。
[0012]本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見(jiàn)的優(yōu)選實(shí)施例從下面的描述和從權(quán)利要求書(shū)中。
【具體實(shí)施方式】
[0013]據(jù)透露，在這里，它可以引入到細(xì)菌宿主基因編碼兩種酶，從而賦予該主機(jī)的能力，以產(chǎn)生3-HP從甘油。這兩個(gè)必要的酶甘油脫氫酶和乙醛脫氫酶。這里報(bào)道，這兩種酶是必需的，足以使合適的宿主的菌株，如大腸桿菌菌株主管，從甘油中，以3-HP。一個(gè)示例性的編碼甘油脫水酶的基因是已知的，DHAB肺炎克雷伯菌，基因的測(cè)序和呈現(xiàn)的方便使用。幾個(gè)示例性的醛脫氫酶是已知的，在這里，它們的序列。從這些信息中，就變成實(shí)際甘油轉(zhuǎn)換成3-HP的能力，以商業(yè)上合理的方式賦予細(xì)菌宿主。
[0014]這是看不出來(lái)的工作完成之前這里描述的，這兩個(gè)不同的酶，可以制造在一個(gè)共同的主機(jī)產(chǎn)生的能力，使3-HP。有許多已知的醛脫氫酶基因，已知有不同的底物特異性和效率的酶。沒(méi)有證據(jù)，這里所描述的工作之前，，醛脫氫酶工作上的(3-HPA)襯底上創(chuàng)建3-HP。如果沒(méi)有這些知識(shí)，沒(méi)有預(yù)測(cè)3-HP生產(chǎn)下面描述的研究的有效性的數(shù)據(jù)。一個(gè)額外的不確定性來(lái)自中間體醛，3-HPA，是有毒的到許多細(xì)菌宿主，宿主的存活依賴于酶的生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化的醛中間體無(wú)毒3的相對(duì)速率的事實(shí)-HP。
[0015]在這里生產(chǎn)的3-HP實(shí)現(xiàn)所需的一個(gè)困難，從非本地主機(jī)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)往往是無(wú)效的，并導(dǎo)致蛋白生產(chǎn)差，而且許多非本土發(fā)起人往往不轉(zhuǎn)錄和酒吧高蛋白表達(dá)。然而，本發(fā)明還認(rèn)識(shí)到，非天然啟動(dòng)子，被稱為是非?；钴S的，是通過(guò)添加一個(gè)小的分子表達(dá)的途徑無(wú)關(guān)的誘導(dǎo)通常是一個(gè)非常有效的方式來(lái)表達(dá)和調(diào)節(jié)表達(dá)的酶的水平宿主(如大腸桿菌)。為了實(shí)現(xiàn)高層次的調(diào)控基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建置于trc啟動(dòng)子的調(diào)控下，從甘油生產(chǎn)3 -羥基丙酸，所有必要的外源基因表達(dá)。trc啟動(dòng)子，高效，原產(chǎn)于大腸桿菌，IPTG此外誘導(dǎo)。
[0016]本說(shuō)明書(shū)中描述了一種從甘油3 -羥基丙酸的生產(chǎn)中使用的遺傳構(gòu)建。遺傳構(gòu)建包括示例性的DNA序列，編碼甘油脫水酶和醛脫氫酶編碼的DNA序列的表達(dá)的。甘油脫水酶的表達(dá)所必需的示例性序列的一組統(tǒng)稱為“DHAB。醛脫氫酶的表達(dá)所必需的序列的一組包括四個(gè)不同的基因，被證明是有效的任何一個(gè)。
[0017]生產(chǎn)3-羥基丙酸
在下面所描述的工作，3 -羥基丙酸，甘油在大腸桿菌中生產(chǎn)所需的酶，trc啟動(dòng)子，通過(guò)加入IPTG誘導(dǎo)的非天然啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)。DHAB肺炎克雷伯氏菌的基因所編碼的，該甘油脫水酶，醛脫氫酶，使用任何一個(gè)的四個(gè)不同的基因，ALD4從釀酒酵母中，從大腸桿菌或從大腸桿菌ALDA的表達(dá)，這些基因編碼甘油脫水酶和編碼醛脫氫酶的基因的任何一個(gè)的時(shí)間是足以使構(gòu)建體生產(chǎn)3-HP的發(fā)酵介質(zhì)時(shí)以甘油。DHAB基因在所有的這些結(jié)構(gòu)中，從所使用的醛脫氫酶的編碼基因的下游，這兩個(gè)基因的表達(dá)由trc啟動(dòng)子的調(diào)控。這樣的順序，但是，并不需要一個(gè)結(jié)構(gòu)上和使用上的多個(gè)構(gòu)造一族的順序是可能的。
[0018]在最小的遺傳構(gòu)建根據(jù)這里所給出的數(shù)據(jù)，唯一的遺傳元件，這將是必要的本的DHAB的結(jié)構(gòu)基因編碼一種蛋白質(zhì)，它有效地催化氧化3 -羥基丙酸，3 -羥基丙醛的醛脫氫酶基因和非天然啟動(dòng)子序列的選擇，得到最適合其構(gòu)建的過(guò)程中要使用的上下文中不同的誘導(dǎo)控制。構(gòu)造中是否保留或增加從其他的DNA序列，外源的DNA片段，將不一定是有效的3-HP合成由宿主生物體是不利的，但就沒(méi)有必要了。必定受到前面翻譯的每個(gè)序列編碼感興趣的蛋白質(zhì)的信使RNA，使核糖體翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，在選定的主機(jī)功能。也將是必要的緊下游的終止子序列的每一個(gè)翻譯單元在一些生物體，特別是在真核細(xì)胞。該構(gòu)造可以是自主復(fù)制的序列的一部分，如質(zhì)粒或噬菌體載體中，或可以整合到宿主的基因組中。
[0019]通過(guò)使用限制性內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)基因和合適的啟動(dòng)子(次)可被分離，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，由相應(yīng)的寡核苷酸的化學(xué)合成的，或者通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的其他方法，在本技術(shù)領(lǐng)域和分子生物學(xué)。子(S)將來(lái)自其他生物的基因組DNA或人工基因結(jié)構(gòu)含有發(fā)起人。將合適的啟動(dòng)子片段連接到幾種可能的安排中任一項(xiàng)的結(jié)構(gòu)基因