一種醇脫氫酶lc3及其基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物工程技術領域，更具體地設及一種醇脫氨酶LC3及其基因和應用。
【背景技術】
[0002] 酬還原酶廣泛存在于高等動、植物W及低等微生物體內。酬還原酶在催化酬、醇時 表現(xiàn)出高度的化學、區(qū)域、對映體選擇性，受到頗多學者的青睞，現(xiàn)成為生物催化領域不可 或缺的催化劑。
[0003] 醇脫氨酶(ADH)家族來源的酶在手性化合物合成中占據(jù)了重要地位。醇脫氨酶對 醒基、酬基、單糖W及酬類固醇具有氧化還原能力。醇脫氨酶可分為鋒離子依賴性的ADH和 非離子依賴性的ADH(短鏈醇脫氨酶)兩個超家族。目前研究最多的是短鏈醇脫氨酶家族。酬 還原酶，作為氧化還原酶系中的一個分支，W還原型煙酷胺腺嚷嶺二核巧酸(NADH)或煙酷 胺腺嚷嶺二核巧憐酸(NADPH)為輔酶，可在溫和的條件下將一系列酬或者醒不對稱還原為 具有光學活性的手性醇。
[0004] 手性藥物是指引入手性的藥物有的一對互為鏡像關系的對映異構體，它們的理化 性質相似，但是立體結構的旋光性有所差異?？煞譃橥庀?、R型（右旋）和S型（左旋)Ξ種。 不同的對映體對于不同的目標具有不同的生物活性，一個異構體是有效的，可能另一個是 無效甚至有害的。手性藥物的用量低、藥效好的特點在臨床治療方面展現(xiàn)出了良好的應用 前景。近年來，隨著對藥物手性特征的深入研究W及對光學異構體的認識度的提高，手性藥 物的市場迅猛增長，而消旋藥物的市場W每年29.5%的速度遞減。如今市場上銷售藥品的 Ξ分之一都為單一的同分異構型，即手性藥物進行銷售。而目前開發(fā)的藥物Ξ分之二都是 手性藥物。
[0005] 手性醇一般可通過天然物質提取、化學合成和生物合成方法獲得。(R)/(S)-4-氯- 3-徑基下酸乙醋(C皿E)是一種非常重要的合成許多藥物化合物的手性中間體?；瘜W合成法 催化產物的能耗高、污染高，相對于生物法有很多缺陷。生物法又分為動力學拆分異構體和 底物不對稱還原制備光學純的CHBE。外消旋體的拆分雖然簡單易行，但是其制備效率不高， 且所得產物為混合物，后期分離困難。
[0006] 生物催化轉化法制備手性化合物是W氧化還原酶及其相關的微生物作為催化劑 催化還原潛手性的底物幾基，生成相應的手性醇。其中利用基因工程菌進行全細胞催化已 成為生物催化生成手性CHBE的發(fā)展趨勢，生物催化法在制備高對映體過量的手性化合物方 面具有效率高、成本低、裝置簡單、對環(huán)境污染小等優(yōu)勢，近年來受到廣泛關注。具有良好的 工業(yè)化前景。
[0007] 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的能夠催化4-氯乙酷乙酸乙醋(C0BE)生成光學醇的4-氯-3-徑基下酸乙 醋(C皿E)的氧化還原酶中大都為生成(S)-C皿E的酶，生成(R)-CHBE的酶比較少見而且轉化 率比較低?，F(xiàn)報道的單水相催化C0BE中最高濃度能夠達到800mM，24h完全轉化生成（R)- CH邸(ee〉99%)。（R)-C皿E可用于合成レ肉毒堿、大環(huán)內醋A、阿法替尼、2,5-環(huán)己二締合成 纖維的關鍵手性中間體，并且能夠轉化為[+ ]負霉素。阿法替尼是一種口服藥物，是表皮生 長因子受體化GFR)和人表皮受體2化ER2)酪氨酸激酶的不可逆抑制劑，用于EGFR外顯子19 缺失和外顯子化85R)取代突變的轉移性非小細胞肺癌患者的一線治療。阿法替尼 (a化t in i b)由德國勃林格殷翰研發(fā)，已于2013年7月獲美國FDA批準上市。目前阿法替尼的 合成路線還是主要W化學合成法來進行。所W生物催化轉化法制備(R)-CH邸具有良好的應 用價值。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種醇脫氨酶LC3及其基因和應用，從而解決現(xiàn)有技術中制 備手性醇的生物酶的缺失。
[0009] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用W下技術方案：
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種醇脫氨酶LC3,其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所 /J、- 〇
[00川所述醇脫氨酶LC3來源于CCTCC Μ 2011381雷氏乳酸桿菌化actobacillus curieae sp.Nov.)。
[0012] 雖然GenBank上公布了一種雙乙酷還原酶，并且具有與上述沈Q ID N0:2相同的氨 基酸序列，也就是說，該段序列在此之前被認為是一種雙乙酷還原酶。但是，所謂雙乙酷還 原酶，主要用于催化還原聯(lián)二酬，而醇脫氨酶屬于酬還原酶的一種，催化還原的是酬基，本 專利利用醇脫氨酶催化還原的是一種酬基。醇脫氨酶來源有很多，但針對該底物進行催化 還原需要進行大量的篩選試驗探索。本領域技術人員一般不會從雙乙酷還原酶推斷出其可 W用來催化還原酬類，因此，目前對于雙乙酷還原酶還停留在催化還原聯(lián)二酬上。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種醇脫氨酶基因 lc3,其堿基序列如SEQ ID N0:1 所示。
[0014] 還提供一種重組質粒，所述重組質粒由所述醇脫氨酶基因 lc3與表達載體質粒連 接構建而成。
[0015] 優(yōu)選地，該表達載體質粒為祀T-28a，構成重組質粒lc3-pET-28a。
[0016] 還提供另一種重組質粒，所述重組質粒由如上所述的醇脫氨酶基因 lc3W及葡萄 糖脫氨酶基因 gdh與表達載體質粒連接構建而成。
[0017] 優(yōu)選地，該表達載體質粒為祀T-28a，構成重組質粒lc3-g化-pET-28a。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供一種表達醇脫氨酶LC3的基因工程菌株，所述基因工 程菌株是將包括醇脫氨酶基因 lc3的重組質粒轉化宿主菌獲得的基因工程菌株。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供一種共表達醇脫氨酶LC3和葡萄糖脫氨酶GDH的基因 工程菌株，所述基因工程菌株是將包括醇脫氨酶基因 lc3W及葡萄糖脫氨酶基因 gdh的重組 質粒轉化宿主菌獲得的基因工程菌株。
[0020] 該葡萄糖脫氨酶基因 GDH含有783bp堿基，其在Genbank中的收錄號為M12276,由該 基因編碼的幾基還原酶，包含260個氨基酸，其在Genbank中的收錄號為AAA22463。
[0021 ] 本發(fā)明從雷氏乳酸桿菌(Xactobacillus curieae sp.Nov.)中提取了醇脫氨酶基 因 lc3,并構建了含有醇脫氨酶基因 lc3的基因工程菌株，從而實現(xiàn)了該醇脫氨酶基因 lc3的 異源表達，所產生的醇脫氨酶LC3具有優(yōu)良的酶學特性，催化還原的溫度范圍為25-50°C，催 化還原pH值為5.0-8.0，在40°C條件下保存2地后還有70 % W上的的殘余酶活。
[0022] 所述醇脫氨酶LC3的催化溫度優(yōu)選為30-40°C，pH優(yōu)選為5.0-7.0。
[0023] 所述醇脫氨酶LC3的催化溫度最優(yōu)選為35°C，抑最優(yōu)選為6.0。
[0024] 目前本領域對于雙乙酷還原酶的研究還僅限于催化還原二碳基，尤其是聯(lián)二酬， 如2,3-下二酬，因此，根據(jù)本領域公知常識，雙乙酷還原酶并不能被用來催化4-氯乙酷乙酸 乙醋生成(R)-4-氯-3?基下酸乙醋。
[0025] 而本發(fā)明還提供一種所述醇脫氨酶LC3W及所述基因工程菌株在合成手性醇類產 品中的應用。
[0026] 特別是所述醇脫氨酶LC3W及所述基因工程菌株被用于催化4-氯乙酷乙酸乙醋生 成(R)-4-氯-3?基下酸乙醋的應用。
[0027] 具體地，本發(fā)明還提供了一種將共表達醇脫氨酶LC3和葡萄糖脫氨酶GDH的基因工 程菌株用于催化4-氯乙酷乙酸乙醋生成(R)-4-氯-3?基下酸乙醋的應用，該應用包括:將 共表達醇脫氨酶LC3和葡萄糖脫氨酶GDH的基因工程菌株培養(yǎng)所得菌體作為催化劑，在W下 反應體系中進行催化反應：pH 5.0~8.0憐酸鹽、LC3-GDH濕菌體、1.5M~2.25M葡萄糖、 0.2mM NA護、1.0M~1.5M C0邸于30~45°C水浴鍋中，攬拌，反應結束，反應液用乙酸乙醋萃 取，收集萃取相，離屯、，取有機相減壓蒸饋回收乙酸乙醋，得到油狀的液體即為(R)-4-氯-3 徑基下酸乙醋的粗品。
[00%]雖然現(xiàn)有技術將該氨基酸序列編碼的蛋白定義為一種雙乙酷還原酶，但是根據(jù)本 領域公知常識，雙乙酷還原酶主要用于催化還原聯(lián)二酬，并不用于催化還原酬基，本發(fā)明首 次發(fā)現(xiàn)由該序列編碼的蛋白也是一種醇脫氨酶，并驚奇地發(fā)現(xiàn)可將其用于催化4-氯乙酷乙 酸乙醋生成重要的手性中間體(R)-4-氯-3?基下酸乙醋。因此，本發(fā)明將由該段序列編碼 的蛋白作為一種醇脫氨酶LC3應用于生物酶法合成手性醇4-氯-3?基下酸乙醋和其他手性 醇類產品的生產中相對現(xiàn)有技術均具有創(chuàng)造性。其中，基于氧化還原反應，在高底物(C0肥） 濃度條件下，在單水相中該醇脫氨酶LC3就已實現(xiàn)高濃度催化合成(R)-CHBE的反應。本發(fā)明 的生物催化法單水相制備手性醇(R)-4-氯-3?基下酸乙醋，產量高達1.46M/L(243.2g/L)。 在此基礎上，本發(fā)明還成功構建了含有葡萄糖脫氨酶g化基因和醇脫氨酶lc3基因共表達的 質粒W及含有該重組質粒的共表達基因工程菌株。與雙菌禪合催化合成手性(R)-CH肥相 比，該共表達基因工程菌具有反應速率快、方便、底物濃度高的特點。
【附圖說明】
[0029] 圖1是本發(fā)明純化的醇脫氨酶LC3的SDS-PAGE圖，其中，Μ為蛋白Marker，1為